Summary

Eine neue Anwendung der Electrical Penetration Graph (EPG) zur Erfassung und Messung elektrischer Signale in Phloem Siebelemente

Published: July 02, 2015
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Summary

Electrical Penetration Graph (EPG) is a well-established technique for studying the feeding behavior of stylet-bearing insects. Here we show a new application of EPG as a non-invasive tool for the acquisition of intracellular electrophysiology recordings of sieve elements (SEs), the cells that form the phloem vasculature in plants.

Abstract

Elektrophysiologischen Eigenschaften von Zellen werden häufig in vitro untersucht, nachdem distanziert sie aus ihrer natürlichen Umgebung. Die Untersuchung der elektrischen Übertragung zwischen entfernten Zellen in einem Organismus erfordert jedoch in vivo, artefaktfreie Aufzeichnungen von Zellen in ihrer natürlichen Umgebung eingebettet. Die Übertragung der elektrischen Signale von bis unverwundete Bereiche in einer Pflanze verwundet ist seit langer Fantasie der Botaniker. Das Phloem, das lebende Teil der Pflanze, die Gefäßsystem in der gesamten Anlage verteilt wird, hat als Hauptgewebe in elektrischen Übertragung in Pflanzen postuliert. Der Mangel an geeigneten elektrophysiologischen Methoden mit zahlreichen Herausforderungen für die Untersuchung der elektrischen Eigenschaften der Phloem-Zellen in vivo. Hier einen neuen Ansatz für die intrazelluläre Elektrophysiologie der Siebelemente (SE), die lebenden Blattläuse oder andere Phloem-Fütterung hemipteran Insekten verwendet, in der elektrischen Eindringen gra integrierten präsentieren wirph (EPG) Schaltung. Die Vielseitigkeit, Robustheit und Genauigkeit dieser Methode war es möglich, zu erfassen und zu untersuchen im Detail die wundinduzierten elektrischen Signale in SEs der zentralen Venen der Modellpflanze Arabidopsis thaliana 1. Hier zeigen wir, dass EPG-Elektroden können leicht für die intrazelluläre elektrophysiologischen Ableitungen von SEs in Rand Venen eingeführt werden, sowie um die Kapazität der SE, mit elektrischen Signalen an mehrere externe Stimuli reagieren zu studieren. Die EPG Ansatz zur intrazellulären Elektrophysiologie des SEs angewendet werden, um eine Vielzahl von Pflanzenarten für viele Forschungsziele umgesetzt werden, in einer Vielzahl von Pflanzen / Insekt Kombinationen und.

Introduction

Die Fähigkeit, Fern elektrische Signale zu erzeugen ist ein vorteilhaftes Merkmal der mehrzelligen Organismen, die für effiziente Reaktionen auf externe Reize ermöglicht. Diese Eigenschaft wurde unabhängig in Pflanzen und Tieren entwickelt, und stellt somit einen Fall konvergente Evolution. Da die elektrischen Signale werden mit wichtigen Funktionen bei Tieren wie neuronale Übertragung und Muskelkontraktion, die molekulare Basis, Mechanismus der Übertragung, und die Funktion der Stimulus-induzierten elektrischen Signale bei Tieren verbunden sind Gegenstand intensiver Forschung. Im Gegensatz dazu hat reizinduzierte elektrische Anzeige in Pflanzen wenig Forschung Aufmerksamkeit erhalten. Obwohl Pflanzen haben keine Nerven oder Muskeln, scheint es genügend Beweise, um davon ausgehen, dass Stimulus-induzierten elektrischen Signale in Pflanzen spielen eine Schlüsselrolle in ihren Reaktionen auf Umweltfaktoren sein.

Das Phloem, das lebendige Komponente der Anlage Gefäßsystem, hat als Hauptunter postuliertstrate für die Übertragung von Stimulus-induzierten elektrischen Signalen aus angeregt / zu nicht-stimulierten / unbeschädigten Bereiche 2 beschädigt. Die wichtigsten Zellen im Phloem sind die Siebelemente (SE), relativ einfach, länglichen Zellen. Die Enden der SE sind an anderen SEs verbunden ist, die eine durchgehende, mit niedrigem Widerstand, Sieb Rohrsystem, das in der gesamten Anlage verteilt wird. Es gibt jedoch nur sehr wenige Untersuchungen über die elektrischen Eigenschaften dieser hochspezialisierten Zellen. In diesen früheren Studien zugegriffen Forscher SEs entweder mit Glasmikroelektroden 3 oder mit Glaselektroden, die verbunden wurden, um zu pflanzen eingefügt Stilette von Blattläusen, nachdem stylectomy (Schneiden) 4. Glasmikroelektroden aus Glaskapillaren, die an einem Ende mit Wärme in einer feinen Spitze von weniger als 1 um im Durchmesser gezogen, und dann mit einer KCl-Lösung gefüllt ist. Eine Ag / AgCl oder Platindraht, in die KCl gefüllte Glaselektrode eingeführt wird dann an den Eingang des Verstärkers verbunden ist und ein BezugspunktElektrode in das Bad um die Zelle von Interesse eingeführt wird, den Stromkreis. Dieser Aufbau wird der Unterschied im Potential zwischen der extrazellulären Referenten Elektrode und der intrazellulären Meßelektrode, dh das Membranpotential der Zelle 5. Mit diesem Verfahren hergestellt Umrath die erste intrazelluläre Aufnahme von einer Pflanzenzelle, wobei die Algen Nitella 6,7. Nitella ist eine relativ einfache Organismen mit großen Zellen, und damit zugänglich für die intrazelluläre Elektrophysiologieexperimente. Im Gegensatz dazu ist das Einfügen von intrazellulärem Glaselektroden in die kleinen Zellen von mehrzelligen, dreidimensionalen Landpflanzen technisch anspruchsvoll, erfordert hochqualifiziertes Forscher, sowie ausgefeilte Visualisierung, Mikromanipulation, und Vibrationsmaschinen. Obwohl Glaselektroden geeignet, von oberflächlichen Zellen in Pflanzen wie Wurzelhautzellen 8 aufzuzeichnen sind, intrazelluläre recordings von Zellen tief in der Pflanze Gewebe, wie SEs, sehr wahrscheinlich zu Schäden induzierten Reaktionen eingebettet, verwirrend die Ergebnisse. 1989, Fromm und Eschrich berichteten über die Verwendung eines alternativen Verfahrens, die so genannte "Blattlaus Methode", bei der Glaselektroden an Blattläusen Stiletts nach stylectomy 4 gekoppelt. Die Blattlaus Verfahren ist minimal-invasiv, weil flexible Stilette verursachen keine Gewebe oder Zellschäden, Glaselektroden zu tun. Aphid Stilette sind der Natur tolle Erfindung für Pflanzen Penetration, und Blattläuse sind deutlich mehr qualifizierte als Menschen bei der Suche nach SEs. Leider ist dieses Verfahren auch Blattlaus anspruchsvolle in Bezug auf technisches Know-how und Ausrüstung. Zusätzlich hängt der Erfolg eines jeden Experiments, die diese Technik umsetzt ganz auf die Blattlaus wobei in Vorschubbetrieb – mit dem Stilett stabil in einer SE eingesetzt, bei der stylectomy. Das Denken in Retrospektive, kann man sehen, dass die Chancen für den Erfolg dieser Technik könnte ich gewesen seinindem dem Versuchsaufbau ein Instrument, das angibt, ob oder ob nicht die Blattlaus Stilett in der SE bei Anwendung stylectomy ermöglicht mproved.

1964, McLean und Kinsey beschrieben ein "elektronisches Überwachungssystem" für die Untersuchung des Fressverhaltens von Blattläusen in Echtzeit 9,10. In diesem System wurden die Blattlaus und das Stilett penetrierten Pflanze in eine elektrische Schaltung integriert ist. Später, im Jahr 1978, entwickelt Tjallingii eine modifizierte Version des Systems, die so genannte 'Electrical Penetration Graph "(EPG) System 11,12. Während der ursprüngliche elektronische Überwachungssystem empfindlich gegenüber den Widerstand-Ursprung Potentiale werden, wobei der EPG-Systems, die elektromotorische Kraft (emf) entstand Potentialen, dh, in der Pflanze oder in das Insekt erzeugt, könnte zusätzlich zu Potenziale aus der aufzuzeichnenden Widerstand (R) in der Insekten. Dies stellt eine wichtige Verbesserung, da beide Signalkomponenten, emf und R,liefern biologische relevante Informationen über Ereignisse während Pflanzen Eindringen von Blattläusen. Was die EPG Vorverstärker empfindlich für die R-Komponenten ist seine relativ niedrigen Eingangswiderstand von 1 G & Omega, die in etwa dem Durchschnitt der Pflanze / Blattlausresistenz ist. Eine geringe Offsetspannung (1, V) von etwa +100 mV wird der Anlage, die dann in Pflanzen und Insekten auf einer Seite unterteilt ist, und der Eingangswiderstand auf der anderen aufgetragen. Die Spannungen und ihre Änderungen an einem Punkt (1A, B) zwischen der Insekten und dem Eingangswiderstand gemessen. Daher werden die R-Komponenten stellen anlagen Blattlausresistenz Modulationen der Offset-Spannung, während die EMK-Komponenten sind ein gewisser Anteil von Pflanzenpotentiale an der Stilettspitze und Potentiale im Insekt verursacht wird. Die Pflanzenpotenziale – relevanteste hier – sind vor allem Membranpotentiale der Pflanzenzellen durch die Blattlaus Stilette punktiert. Die Insekten Potentiale offensichtlich in erster LinieStrömungspotentiale durch Flüssigkeitsbewegungen innerhalb der beiden Stilett Kanälen verursacht, dh, das Essen und die Speichelgänge; keine internen Nerven- oder Muskelpotentiale sind in der EPG aufgezeichnet. In der Praxis sind die Stilettspitze dient als Elektrodenspitze. Alle Pflanzenzellen negativ innen relativ zur positiven Außenseite der Zelle geladen. Der elektrische Strom (dh die Bewegung geladener Ionen in wässriger Lösung) von innen nach außen und umgekehrt fließt, sehr durch die hohe Beständigkeit der Zellmembran beschränkt. Normalerweise wird das Ruhepotential konstant gehalten wird. Allerdings, wenn negative Ionen ausziehen oder positiven Ionen bewegen sich in die Zellmembran, wird das Membranpotential reduziert, dh, es depolarisiert. Depolarisation bei Zellanregung. Ionen treffen dann in oder aus zu bewegen, wenn bestimmte Ionenkanäle in der Membran geöffnet werden, oder wenn die Membran beschädigt und Ionen austreten und aus. Alle Zellen haben Ionenkanäle und Pumpen in tHe-Plasmamembran, die das Membranpotential in seine Ruheniveau zu bringen, indem die ursprüngliche Konzentration der verschiedenen Ionen innerhalb der Zelle. Das Ruhepotential und seine Veränderungen EMK-Komponenten, und daher ist die EPG geeignete Technik, um sie zu messen.

Abbildung 1
Abbildung 1. EPG-Elektroden. Die EPG-Elektrode ist ein lebendiges Blattlaus in die Elektrik Penetration Graph (EPG) Schaltkreis, dessen Führungsstab wird in ein Sieb Element (SE) in Stallfütterung Modus eingefügt integriert. Wenn das Stilett-aufgespießt SE in Ruhe ist (Feld A), wird die Spannung in der Schaltung von EPG aufgezeichnet wird, ist stabil und in der Ruhepotentialpegel (Tafel C, Rest). Wenn das SE angeregt wird, dessen Membran depolarisiert (Feld B), die in der EPG als eine allmähliche Zunahme der Spannung (Panel C Depolarisation) sichtbar gemacht wird. Da das Ionengleichgewicht in der SE kehrt zur Ruhe, das heißt es repolarIZES, die Spannung von EPG aufgezeichnet allmählich auf den Rest Potentialpegel (Tafel C, Repolarisation). In Panel C, "A" und "B" beziehen sich auf die in den Feldern A und B, gezeigt Szenarien. V = einstellbare Offset-Spannungsquelle. Ri = Eingangswiderstand. Parallel zum 1 GOhm externen Widerstand besitzt der Verstärker eine interne (in der OpAmp) hoch 1,5 Tw Widerstand (Platten A und B, in grau). Durch die Fernsteuerung des Schalters die EPG Vorverstärker kann von normal bis Forschungszentrum für Elektro-Modus, der ermöglicht den Erhalt hochgenaue Spannungswerte geändert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Im nächsten Abschnitt stellen wir die Leser mit einem Basisprotokoll für die Durchführung EPG Experimente, die für beide Insekten konzentriert und Pflanzenstudien konzentriert ist.

Protocol

1. Blattlaus Aufzucht Hinweis: Die Auswahl der Anlagen und Blattlaus-Arten für EPG Aufnahmen hängt von der Forschungsziel. Für Untersuchungen an Arabidopsis thaliana ist die Blattlaus Brevicoryne brassicae angemessen. Rück B. brassicae Blattläuse in einem Gewächshaus auf Brassica oleracea. Halten Sie die für die Blattlaus Aufzucht in Käfigen verwendeten Pflanzen, um zu vermeiden, verunreinigen anderen Pflanzen. Halten Sie Blattlaus Erzie…

Representative Results

In einer früheren Studie haben wir die EPG-Elektrodentechnik mit dem Zweck der Charakterisierung der elektrischen Signale in SEs des Mittelader während Raupe Angriff 1 hergestellt implementiert. Die Mittelader ist eine bevorzugte Insertionsstelle für konventionellen Glaselektroden, sowie für Glas Mandrin Elektroden, weil es SE-dichten und relativ robust, damit zugänglich für die Fixierung für die Implementierung dieser Techniken benötigt. Dabei nutzten wir die Vielseitigkeit des EPG-Elektrode mit dem …

Discussion

Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll zur elektrischen Penetration Graph (EPG) Aufnahmen. Die EPG-Technik ist gut etabliert, mit 100-200 aktive Nutzer weltweit, und es hat für viele Studien zu verschiedenen Themen, zum Beispiel implementiert: a) Resistenz von Wirtspflanzen auf Blattläuse und andere Stilett tragenden Insekten 13; b) Pflanzenvirus und Erreger Übertragungsmechanismen 14; c) Insektizid Wirkungsweise (Toxizität und Verhaltensänderungen) 15; d) EPGs wurden s…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

VSR wurde durch ein Marie-Curie-Finanzhilfe IIF unterstützt (Wunde in EARTH, Akronym für: Wound induzierte elektrische Signale in Arabidopsis thaliana).

Materials

Brass connector pins EPG Systems/hardw.shop Φ 1.2 mm
Thin copper wire EPG Systems/hardw.shop approx. Φ 0.2 mm
Thin gold wire EPG Systems Φ 18 µm
Soldering fluid hardware shop matching the soldering wire
Resin-cored soldering wire hardware shop
Styrofoam any
Water-based silver glue EPG systems recipe in: www.epgsystems.eu
Paper wipes Kimberly-Clark 5511
Soldering bolt any
Stereomicroscope Hund Wetzlar minimum magnification is x10
Small scissors Fine Science Tools 14088-10
Scalpel Fine Science Tools 10050-00
Fine forceps Fine Science Tools 11231-20
Vortex A. Hartenstein L46
Watercolor brushes any Number 1 or 2
Air suction device see description in: www.epgsystems.eu
Insect pins any No. 1 or 2
Solid table
Faraday cage Hand made
Computer Fujitsu Siemens
Data acquisition software EPG Systems Stylet+d
Giga-4 (-8) Complete System EPG Systems
includes the following:
Main control box with USB output Di155/Di710 12/14 bit, rate 100Hz(softw. fixed)
EPG probes 4 (8) 50x DC pre-amplifier
Swivel clamps on rod
DC power adaptor bipolar, 230/115 VAC to -/+8 VDC
Plant electrodes and cables
Additional test and ground cables 

Referencias

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Salvador-Recatalà, V., Tjallingii, W. F. A New Application of the Electrical Penetration Graph (EPG) for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements. J. Vis. Exp. (101), e52826, doi:10.3791/52826 (2015).

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