Summary

뇌실 주위 백질 성인 쥐의 지역 및 인간의 척수에서 신경 줄기 / 전구 세포의 분리

Published: May 14, 2015
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Summary

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Abstract

성인 쥐 및 성장 인자가 풍부한 배지에서 배양 인간 척수 신경 줄기 / 선조 세포 (NSPCs)는 자기 갱신, 및 확장 신경 줄기 세포의 분화능 증식을 허용한다. 혈청 조건에서 이러한 능성 NSPCs는 신경 세포, 성상 세포 및 희소 돌기 아교 세포를 생성, 차별화됩니다. 수확 된 조직의 bFGF (효소 파파인-EDTA 용액 중에서 해리 한 후 기계적으로 표피 성장 인자 (EGF)가 보충 된 배지로 Neurobasal 배지, 염기성 섬유 아세포 성장 인자에 도금 단일 세포 현탁액을 수득 해리 불연속 밀도 구배를 통해 분리되고 ) 및 헤파린. 성인 쥐 척수 NSPCs은 자기편 문화로 성장 자유 부동 neurosphere를 성인 인간의 척수 NSPCs으로 배양. 이러한 조건 하에서, 성인 척수 NSPCs은 전구 세포의 마커 익스프레스, 증식, 연속적 통로에 확장 될 수있다. 이러한 세포 수 bE는 다양한 자극에 반응하여 시험관 내에서 연구 및 외인성 인자는 신경 줄기 세포의 분화를 검사 혈통 제한을 촉진하기 위해 사용될 수있다. 능성 NSPCs 또는 그들의 자손 또한 회생 수리를 평가하기 위해 다양한 동물 모델에 이식 할 수있다.

Introduction

NSPCs 자기 갱신과 쉽게 체외에서 확장 할 수 있습니다 신경 혈통하기 위해 최선을 다하고 다 능성 세포이다. 그들은 자기 갱신 다 능성 줄기 세포보다 제한 조상의 속성을 표시하기 때문에 우리는 신경 줄기 / 전구 세포의 혼합 인구로이 세포를 참조하십시오. NSPCs은 태아와 성인 뇌와 척수 1, 2 모두에서 발견된다. 성인에서, NSPCs는 일반적으로 대기하고 측면 심실 2-4 안감 뇌실 영역 및 척수 5,6의 중심 운하를 둘러싼 뇌실 주위 백질 영역을 포함하는 특정 틈새 시장 내에 위치.

일반적으로, NSPCs는 EGF와 bFGF를 보충 무 혈청 배지에서 자유 부동 neurosphere를 또는 부착 단일 층, 줄기 / 전구 세포 집단에 대한 선택 분열 촉진으로 배양. 원래 레이놀즈와 바이스 (2)에 의해 개발 된 neurosphere 분석은 가장 일반적으로 문화에 사용되며,신경 줄기 세포를 확장합니다. 그들이 성장 인자 배지 포함 혈청에 도금 할 때 NSPCs는 신경 세포, 성상 세포 및 희소 돌기 아교 세포로 분화, 능성을 보여줍니다. 배양 된 조직이 중앙 운하 6,7의 영역을 포함하는 경우 다 능성, 자기 갱신 NSPCs은 성인 쥐에서 척수를 분리하고 배양 할 수있다. 다른 영역으로부터 세포를 생성 반대로 성인 척수에서 생성 NSPCs 사용에 잠재적 이점이 조직 – 특이 적 세포가 가장 근접 부상이나 질병 다음 분실되거나 손상된 척수 세포 유사 있다는 것이다.

이전의 연구는 인간 성인 척수로부터 유래 neurosphere를 장기 또는 세포를 전파 8,9 충분한 수를 생성하기 위해 계대 수 없다는 것을 보여 주었다. 그러나, 배양 조건의 수정을, 우리는 시연, 성인의 척수 유래 NSPCs의 확장과 이식을보고 그 자체 갱신및 다 능성 NSPCs는 장기 이식 공여자 (10)의 성인 인간 척수로부터 분리 될 수있다. 주로, 성장 인자가 풍부한 배지에서 부착 기판에 절개 및 이들 세포를 배양 중에 백질의 대부분의 제거는 인간 성인 척수 NSPCs 증식 선정. 이 프로토콜에서 우리는 성인 쥐에서 인간의 장기 이식 기증자, 뇌실 주위 조직의 절개 및 NSPCs의 분리, 배양 및 확장에서 척수의 수확에 대해 설명합니다.

Protocol

모든 동물의 절차는 동물 관리에 캐나다위원회에 의해 제조 된 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 설립 정책에 따라, 캐나다 동물 관리 대학 건강 네트워크의위원회, 토론토에 의해 승인됩니다. 인간의 척수 조직의 수확 용, 승인 대학 건강 네트워크 연구 윤리위원회에서 온타리오, 캐나다에 장기 기증을 감독 생활 재단의 트릴 – 선물로부터 얻은 것입니다. 해부 버퍼 …

Representative Results

EFH 매체에 현탁 배양에서 자란 성인 쥐 척수 세포는 초기 도금의 일주일 내 작은 neurosphere를 (미분화 세포의 콜로니)을 형성한다. 차 배양에서 도금 셀의 대부분은 죽게되고 성장 인자 응답 줄기 세포가 증식되고 EFH 매체에 대해 선택된다. 통로 (3)에 의해, 다수의 자유 부동 neurosphere를 약 100 μm의 직경 (그림 2A)에있을 것입니다. neurosphere를 라운드 및 위상 밝은이며, 고배율, 섬모 형상 m…

Discussion

쥐의 척수 조직 관리의 해부 동안 추궁 절제술을 수행하는 동안 척수 손상되지 않도록주의해야한다. 이것은 척수 세그먼트 그대로 때 뇌실 조직을 분리하기 쉽다. 조직 세그먼트 완전히 해부 완충액에 침지되어야하고 덮는 수막과 백질은 microscissors와 스트립 길이로 절단 할 수있다. 또한, 미세 조직 집게 멀리 백질을 벗겨하는 데 사용할 수 있습니다.

NSPCs위한 분리 과정을 ?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge support from Spinal Cord Injury Ontario, the Ontario-China Research and Innovation Fund, the Toronto General and Western Hospital Foundation, and Physicians’ Services Incorporated Foundation. The authors thank Dr. Tasneem Zahir for expert advice in human spinal cord NSPC culture, and Drs. Cindi Morshead and Iris Kulbatski for their expert advice in rat spinal cord NSPC isolation.

Materials

1X PBS Life Technologies #10010023 Dissection buffer
1X HBSS Life Technologies #14175095 Dissection buffer
D-glucose Sigma # G-6152 Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix
Penicillin-Streptomycin Life Technologies #15140-148 Dissection buffer and culture medium
Neurobasal-A  Life Technologies #10888-022 Culture medium
L-glutamine, 200mM Life Technologies #25030-081 Culture medium
B27 Life Technologies #12587010 Culture medium
DMEM Life Technologies #11885084 Hormone mix
F12 Life Technologies #21700-075 Hormone mix
NaHCO3 Sigma # S-5761 Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix
HEPES Sigma #H9136 Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix
Insulin Sigma #I-5500 Hormone mix
Apo-transferrin Sigma #T-2252 Hormone mix
Putrescine Sigma # P7505 Hormone mix
Selenium Sigma #S-9133 Hormone mix
Progesterone Sigma #P-6149 Hormone mix
EGF, mouse Sigma #E4127 Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
EGF, human recombinant Sigma #E9644 Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
bFGF, human recombinant Sigma #F0291 Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium 
Heparin, 10000U Sigma #H3149 Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium
Papain dissociation kit Worthington Biochemicals #LK003150 Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA
Sodium Pentobarbital Bimeda – MTC Animal Health Inc DIN 00141704
Tissue Forceps: Addisons Fine Science Tools #11006-12  Serrated standard tip; micro-tip also available
Fine Forceps: Dumont #4 Fine Science Tools #11241-30
Microscissors Fine Science Tools #15024-10 Round-handled Vannas
Rongeurs Bausch & Lomb N1430
10mm Petri dishes  Nunc 1501
T25 Culture flasks Nunc 156367
40 μm nylon cell strainer VWR CA21008-949
6 well plates Nunc CA73520-906
Matrigel, growth factor reduced (100X) Corning 354230 Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM

Referencias

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Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord. J. Vis. Exp. (99), e52732, doi:10.3791/52732 (2015).

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