El aislamiento y criopreservación de rata neonatal cardiomiocitos
Summary
The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.
Abstract
Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for α-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.
Introduction
El cultivo celular de los cardiomiocitos es una herramienta fundamental en la investigación cardiaca moderna. Cardiomiocitos de rata neonatal (NRMCR) son de uso general ya que el aislamiento y la cultura es más fácil que la de los cardiomiocitos de rata adulta 1. El método NRCM todavía tiene varias limitaciones, incluyendo un procedimiento de aislamiento de largo y la proliferación celular limitado en el plato. Hay numerosos protocolos para el aislamiento de NRMCR con la mayoría requiriendo generalmente 4-48 hr de trabajo 2-6. Además, las células se aíslan con frecuencia de 1 a cachorros de 2 días de edad de rata 2,4-7; el momento del nacimiento puede ser impredecible y el conflicto con otros trabajos en el laboratorio. Los aislamientos pueden ser ineficiente y derrochador si se necesita sólo una pequeña cantidad de células para los experimentos. La mayoría de los esfuerzos en mejorar el enfoque del flujo de trabajo en la reducción del tiempo de aislamiento, sin embargo, esto no resuelve el problema de medir el tiempo del nacimiento de las crías.
Como alternativas, muchos laboratorios utilizancardiomiocitos derivados de células madre embrionarias (CES) o las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). Sin embargo, el proceso de reprogramación y / o diferenciación puede ser muy lento y costoso también. No puede haber otros problemas al utilizar estas células como modelos miocitos in vitro. Ambos cardiomiocitos derivados Esc- y iPSC- han demostrado que presentan diferencias en la electrofisiología de cardiomiocitos primarios 8-10.
NRMCR disociadas son capaces de ser almacenado durante varios días utilizando refrigeración 11, sin embargo, esto no permiten el almacenamiento a largo plazo. El nitrógeno líquido se utiliza típicamente para preservar las células de un mayor período de tiempo, sino que requiere un crioprotector tal como sulfóxido de dimetilo (DMSO). Investigaciones anteriores han demostrado que la concentración ideal entre 5-10% de DMSO en los medios de congelación permite la criopreservación de NRMCR, pero aun así la viabilidad sigue siendo baja 12. Aunque DMSO ayuda a proteger las células durante gratuitazing, puede ser tóxico para las células a concentraciones por encima de 1,5% 13. Estudios anteriores han demostrado que la eliminación lentamente DMSO de las células, puede mejorar la viabilidad celular 14.
Hemos tratado de mejorar la eficiencia de los ensayos basados en células NRCM por criopreservar las células después del aislamiento. Esto permite que las células se descongelaron y se utilizan cuando sea necesario, reduciendo la frecuencia de aislamientos y el consumo de los animales. Usando este método, se muestra que es posible criopreservar NRMCR y descongelar para su uso en un momento posterior. Después de descongelar las células mantienen una viabilidad aceptable y producen culturas NRCM que son positivas para α-actinina sarcomérica (α-SA) y el contrato de forma espontánea.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo permite a los NRMCR a ser aislados, criopreservadas y descongeladas. Descongelación de las células es una parte crucial del procedimiento. Una serie de diluciones de DMSO se utiliza para eliminar lentamente DMSO de las células 14. Es importante que la extracción de DMSO realizarse rápidamente ya que las células son particularmente sensibles a morir inmediatamente después de la descongelación. Si se requieren células más o menos para la descongelación, los volúmenes de las soluciones…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by funding from American Heart Association 12BGIA12040477, NC State University Chancellor’s Faculty Excellence Program, and National Natural Science Foundation of China H020381370216.
Materials
| IMDM (+25mM HEPES +L-glutamine) | Gibco | 12440-046 | With added 25mM HEPES and L-glutamine |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| HBSS (+Ca +Mg) | Corning | 21-020-CV | With added calcium and magnesium, pH 7.1-7.4 |
| Trypsin 0.25% | Gibco | 25300-056 | |
| Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | Freezing media |
| Cryogenic Vial | Corning | 430659 | |
| Collagenase | Sigma | C1889-50MG | |
| 40μm Cell Strainer | Greiner Bio-One | 542040 | |
| Sterilizing Vacuum Filter (0.22μm) | Corning | 431118 | |
| 50mL Conical | Corning | 430828 | |
| 15mL Conical | Corning | 430790 | |
| trypan blue | Cellgro | 25-900-CI | |
| Mr Frosty Freezing Container | ThermoScientific | 5100-0001 | |
| Millicell EZ SLIDES | Millipore | PEZGS0416 | |
| α-sarcomeric actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Bromodeoxyuridine | BD Biosciences | 51-7581KZ |
Referencias
- Louch, W. E., Sheehan, K. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Miragoli, M., Salvarani, N., Rohr, S. Myofibroblasts Induce Ectopic Activity in Cardiac Tissue. Circulation Research. 101, 755-758 (2007).
- Simpson, P., Savion, S. Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells. Cross-striations, ultrastructure, and chronotropic response to isoproterenol. Circulation Research. 50 (1), 101-116 (1982).
- Simpson, P., McGrath, a., Savion, S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines. Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).
- Rohr, S., Flückiger-Labrada, R., Kucera, J. P. Photolithographically defined deposition of attachment factors as a versatile method for patterning the growth of different cell types in culture. Pflügers Archive : European Journal of Physiology. 446 (1), 125-132 (2003).
- Zhang, B., Green, J. V., Murthy, S. K., Radisic, M. Label-free enrichment of functional cardiomyocytes using microfluidic deterministic lateral flow displacement. PloS One. 7 (5), e37619 (2012).
- Boateng, S. Y., Hartman, T. J., Ahluwalia, N., Vidula, H., Desai, T. Inhibition of fibroblast proliferation in cardiac myocyte cultures by surface microtopography. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 285 (1), C171-C182 (2003).
- Fu, J. -. D., Li, J., et al. Crucial role of the sarcoplasmic reticulum in the developmental regulation of Ca2+ transients and contraction in cardiomyocytes derived from embryonic stem cells. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (1), 181-183 (2006).
- Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. a Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation. Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).
- Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
- Uchida, T., Nagayama, M., Taira, T., Shimizu, K., Sakai, M., Gohara, K. Optimal temperature range for low-temperature preservation of dissociated neonatal rat cardiomyocytes. Cryobiology. 63 (3), 279-284 (2011).
- Miyamura, K., Nagayama, M., et al. Evaluation of viability of cryopreserved rat cardiac myocytes and effects of dimethyl sulfoxide concentration on cryopreservation. Cryobiology. 59 (3), 375 (2010).
- Rana, P., Anson, B., Engle, S., Will, Y. Characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: bioenergetics and utilization in safety screening. Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 130 (1), 117-131 (2012).
- Yokomuro, H., Mickle, D. a. G., Weisel, R. D., Li, R. -. K. Optimal conditions for heart cell cryopreservation for transplantation. Molecular and Cellular Biochemistry. 242 (1-2), 109-114 (2003).
- Simpson, P., McGrath, a., Savion, S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines. Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).
- Evans, H. J., Western Goodwin, R. L. array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development. Molecular and Cellular Biochemistry. 303 (1-2), 189-199 (2007).
- Golden, H. B., Gollapudi, D., et al. Methods in Molecular Biology. , 205-214 (2012).
- Zlochiver, S., Muñoz, V., Vikstrom, K. L., Taffet, S. M., Berenfeld, O., Jalife, J. Electrotonic myofibroblast-to-myocyte coupling increases propensity to reentrant arrhythmias in two-dimensional cardiac monolayers. Biophysical Journal. 95 (9), 4469-4480 (2008).
- Chang, M. G., Zhang, Y., et al. Spiral waves and reentry dynamics in an in vitro model of the healed infarct border zone. Circulation Research. 105 (11), 1062-1071 (2009).
