Förenklad Human Neutrofila Extracellulär Fällor (NET) Isolering och Hantering

Neutrofila cellulära fällor (nät) är nyupptäckta neutrofilspecifika härledda element består av strängar av extracellulärt DNA dekorerade av hundratals proteiner och histoner. De utsöndras av neutrofiler i samband med infektion och inflammation följande specifika stimuli och de ursprungligen erkänt att vara en del av neutrofila försvarsmekanismer mot infektioner. De var först visat att främja infångning av olika mikrobiella inkräktare inklusive bakterier, virus och svampar ^1-3. Svällning av mikroben skulle då leda till dess undergång både direkt av NET-associerade proteiner ^3,4 och indirekt genom lokal rekrytering av fagocytceller ^5,6. Roll NET dock inte verkar vara begränsat till värdförsvaret. På senare tid har de visat sig spela en viktig roll vid autoimmuna sjukdomar ^7,8, trombos ^9, graviditetsrelaterade störningar ¹⁰ och även cancer progression^11,12. Följaktligen förefaller det som NET spelar en viktig roll i ett stort antal olika fysiologiska processer. Men med tanke på nya karaktären av sådan forskning, återstår mycket att belysas med avseende på de mekanismer genom vilka NET utövar sina effekter. Häri, presenterar vi en förenklad metod för isolering av NET i frånvaro av neutrofiler.

I följande video visar vi en förenklad och enkel teknik för att isolera NET från humant helblod. Cellfria NET kan sedan användas i ett antal in vitro-försök, vilket omfattar färgning, imuunofluorescence, läsk liksom ett antal analyser, såsom adhesion, spridning och migrering. Andra protokoll existerar ^{13, 19,} men de är vanligen långa, komplexa, dyra och ofta, lågt utbyte ^13. Detta förenklade protokoll använder basiska reagens och minskar antalet steg som krävs för att isolera neutrofiler således minimera längden av procedure samtidigt maximera avkastningen.

Följande metod kombinerar olika tekniker för neutrofil isolering tidigare beskrivits i litteraturen för att erhålla ett enkelt protokoll vilket gav ett mycket rent prov av levande neutrofiler. Som föreslås i litteraturen, är venöst blod samlas i EDTA-rör och används inom 10 minuter för att undvika neutrofilaktivering ^14. Vi använder lymfocytseparationsmedium media (LSM) densitetsgradientcentrifugering för att isolera granulocyter och röda blodkroppar från hepariniserat helblod, en metod anpassad från Ficoll densitetscentrifugering teknik initialt beskrivits av Boyum m.fl. ^15. LSM är en modifiering av Boyum formulering som ersätter natrium diatrizoat för natrium metrizoate och har använts med framgång i många studier att isolera neutrofiler ^16-18.

Efter differentiell densitetscentrifugering, är monocyter och lymfocyter kastas; röda blodkroppar är sedan sedimentmed hjälp av en 6% dextran-lösning ¹⁴ och de återstående RBC lyseras för att erhålla en population av rena neutrofiler, vilket verifieras med trypanblått och metylenblått färgning.

Talrika medel har använts för att inducera NETosis både in vitro och in vivo, inkluderande lipopolysackarid (LPS), och forbolmyristatacetat (PMA) och interleukiner (IL-8) ^3,5,6. I följande protokoll, är isolerade neutrofiler stimuleras med 500 nM PMA under 4 timmar, vilket har visat sig vara en lämplig koncentration för att möjliggöra en konsekvent och pålitlig NET bildning utan att främja apoptos ^19,20.

Efter isolering, visar vi hur cellfria NET erhållna från detta protokoll kan användas i en adhesionsanalys. DNAse1 används för att smälta och bryta ned NET såsom tidigare beskrivits och tjänar sålunda som en kontroll ^2,3,11. Andra alternativ är att använda neutrofilelastas hämmare (NEi) att hämma NET formatipå, vilket är ett acceptabelt alternativ när målet är att hämma NET bildningen i stället påverka deras nedbrytning ^11. Även NEi har ett antal olika funktioner, har det tidigare visat att NET nedfall kan hämmas genom NEi genom blockering av kromatin decondensation, kärnkraft degranulation och neutrofil död ¹²