In de onderstaande voorschriften beschrijven we een zeer eenvoudige manier om neutrofielen extracellulaire vallen (NET) uit humaan totaal bloed met gemakkelijk beschikbare reagentia isoleren. Wij dan tonen hoe de geïsoleerde netten kunnen worden gebruikt de een in vitro adhesietest met kankercellen.
Neutrofielen Extracellular traps (NET) zijn onlangs geïdentificeerd als onderdeel van antimicrobiële armamentarium de neutrofielen's. Naast hun rol bij de bestrijding van infecties, heeft recent onderzoek aangetoond dat zij betrokken zijn bij vele ziekteprocessen, met inbegrip van kanker progressie. Isoleren gezuiverd NET is een cruciaal element om de studie van deze functies mogelijk te maken.
In deze video tonen we een vereenvoudigde werkwijze voor celvrije NET isolatie uit humaan totaal bloed met gemakkelijk beschikbare reagentia. Geïsoleerde netten kunnen vervolgens worden gebruikt voor immunofluorescentie kleuring, blotting of verschillende functionele assays. Dit maakt een beoordeling van hun biologische eigenschappen bij afwezigheid van de mogelijke verstorende effecten van neutrofielen zelf.
Een dichtheid gradiënt scheidingstechniek toegepast om neutrofielen uit gezonde donor volbloed te isoleren. Geïsoleerde neutrofielen worden dan gestimuleerd door forbol 12-myristate 13-acetaat (PMA) aan NETosis induceren. Geactiveerde neutrofielen worden dan weggegooid, en een cel-vrij NET voorraad wordt verkregen.
Vervolgens hebben we zien hoe geïsoleerd netten kunnen worden gebruikt in een adhesietest met A549 menselijke longkankercellen. De NET voorraad wordt gebruikt voor het bekleden van de putjes van een 96 putjes celkweekplaat O / N, en na een adequate NET monolagen bodem van de putjes, CFSE gelabelde A549 cellen worden toegevoegd. Hechtende cellen worden gekwantificeerd met behulp van een Nikon TE300 fluorescentiemicroscoop. In sommige putten, wordt 1000U DNAse1 10 min voordat het tellen naar NET degraderen toegevoegd
Neutrofielen extracellulaire vallen (NET) zijn nieuw ontdekte neutrofiel-afgeleide elementen opgebouwd uit strengen van extracellulair DNA ingericht door honderden eiwitten en histonen. Zij worden uitgescheiden door neutrofielen in de context van infectie en ontsteking na specifieke stimuli en werden initieel gedeelte van afweermechanismen neutrofielen tegen infecties. Ze werden voor het eerst getoond aan het opsluiten van verschillende microbiële indringers zoals bacteriën, virussen en schimmels 1-3 te bevorderen. Het vangen van de microbe zou dan leiden tot de vernietiging zowel direct door-NET-geassocieerde eiwitten 3,4 en indirect via de lokale werving van fagocyterende cellen 5,6. De rol van NET betekent echter niet te worden beperkt tot de verdediging te organiseren. Recenter bleken ze een belangrijke rol in auto-immuunziekten 7,8 spelen, trombose 9, zwangerschap gerelateerde aandoeningen 10 en zelfs progressie van kanker11,12. Derhalve blijkt dat NET spelen een belangrijke rol in een groot aantal verschillende fysiologische processen. Gezien het nieuwe karakter van dergelijk onderzoek, nog veel worden toegelicht met betrekking tot de mechanismen die NET hun werking uitoefenen. Hierin presenteren we een vereenvoudigde werkwijze voor de isolatie van netten voor de afwezigheid van neutrofielen.
In de volgende video, demonstreren we een eenvoudige en gemakkelijke techniek om NET's uit humaan totaal bloed geïsoleerd. Celvrije netten kunnen vervolgens worden gebruikt in verschillende in vitro experimenten, waaronder kleuring imuunofluorescence, evenals blotting een aantal testen zoals hechting, proliferatie en migratie. Andere protocollen bestaan 13, 19, maar ze zijn vaak langdurig, ingewikkeld, duur en vaak lage opbrengst 13. Deze vereenvoudigde protocol gebruikt basische reagentia en vermindert het aantal stappen om neutrofielen te isoleren, dus het minimaliseren van de lengte van de procedure terwijl het maximaliseren van de opbrengst.
De volgende methode combineert verschillende technieken voor neutrofielen isolatie eerder in de literatuur beschreven van een eenvoudig protocol waarbij een zeer zuiver monster van levende neutrofielen verkrijgen. Zoals voorgesteld in de literatuur, wordt veneus bloed in EDTA-buizen en binnen 10 minuten tot neutrofiel activatie 14 voorkomen. We gebruiken lymfocyt scheidingsmedium (LSM) dichtheidsgradiënt centrifugering granulocyten en rode bloedcellen te isoleren uit gehepariniseerd volbloed, een aangepaste werkwijze uit de Ficoll dichtheidscentrifugatie techniek oorspronkelijk beschreven door Boyum et al 15. LSM is een modificatie van de Boyum formulering die natrium diatrizoaat vervangt het natrium metrizoate en is met succes gebruikt in veel studies neutrofielen 16-18 isoleren.
Na differentiële dichtheid centrifugatie, monocyten en lymfocyten worden verwijderd; rode bloedcellen worden vervolgens gesedimenteerdmet een 6% dextran-oplossing 14 en de overblijvende rode bloedcellen worden gelyseerd om een populatie van zuivere neutrofielen, die wordt gecontroleerd met trypan blauw en methyleenblauw kleuring te verkrijgen.
Talrijke middelen zijn gebruikt om NETosis induceren zowel in vitro als in vivo, waaronder lipopolysaccharide (LPS) en forbolmyristaatacetaat (PMA) en interleukinen (IL-8) 3,5,6. In het volgende protocol worden geïsoleerde neutrofielen gestimuleerd met 500 nM PMA gedurende 4 uur, waarvan is aangetoond dat een voldoende concentratie consistente en betrouwbare nettovorming toestaan zonder bevorderen apoptose 19,20 zijn.
Na isolatie tonen we hoe celvrije NET verkregen van de protocol kan worden gebruikt in een adhesietest. DNAse1 wordt gebruikt verteerbaar en degraderen NET eerder beschreven en dus dient als controle 2,3,11. Andere opties zijn het gebruik van neutrofielelastase remmer (NEI) naar NET formati remmenop, hetgeen een aanvaardbaar alternatief wanneer het doel is het NET te remmen dan bewerkstelligen de afbraak ervan 11. Hoewel NEI heeft een aantal zeer gevarieerde functies, is eerder aangetoond dat NET depositie kan worden geremd door NEI door verstopping van chromatine decondensatie, nucleaire degranulatie en neutrofielen dood 12
De neutrofielen extracellulaire Trap isolatie protocol gedemonstreerd in deze video combineert verschillende technieken die gebruikt worden in de literatuur voor neutrofielen isolatie en NET formatie. Het vereenvoudigt een vrij complex en variabel proces en biedt een zeer betrouwbare en reproduceerbare manier om gezuiverd cel-vrije NET's met minder stappen dan andere protocollen te isoleren. Bovendien zijn gemakkelijk verkrijgbaar reagentia toe te voegen aan de protocollen eenvoud en de kosten aanzienlijk vermindere…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Wisent | 311-425-CL | |
Lymphocyte Separation Medium (LSM) | Wisent | 305-010-CL | |
Dextran hydrochloride (powder) | Spectrum | DE130 | 6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder |
RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | 3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum |
BD Pharm Lyse Lysing buffer | BD Biosciences | 555899 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Alrdrich | P8139 | |
DNAse1 | Roche | 11284932001 | |
F12 DMEM | Wisent | 319-075-CL | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
CFSE | Invitrogen | C1157 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
Integrid tissue culture dish with 20mm grid (150 x 25mm) | Falcon | 353025 |