À long terme intravitale microscopie multiphotonique imagerie des cellules immunitaires dans sains et malades du foie en utilisant des souris CXCR6.Gfp Reporter

La visualisation des cellules et des fonctions cellulaires dans des organes entiers, voire des organismes entiers a été d'un grand intérêt pour les plus de 50 ans, y compris presque toutes les parties du corps ^2. Par conséquent, certaines études antérieures déjà employés imagerie intravitale du foie ^3,4. Cependant, plusieurs limitations existent à jour concernant stable à long terme imagerie à haute résolution des tissus du foie.

En raison de la position anatomique du foie en contact étroit avec la membrane et le tractus gastro-intestinal ^5, le problème le plus commun pour l'imagerie microscopique intravitale mouvement est due à la respiration et, dans une moindre mesure, péristaltique de l'intestin ^6. En comparaison à d'autres organes solides, la chirurgie du foie est particulièrement difficile. En raison de la structure microvasculaire dense, manipulation chirurgicale peut entraîner des lésions hémorragiques massifs, troubles de la microcirculation ⁷ et également l'activation de résident immune cellules telles que des cellules de Kupffer ^8. Par conséquent, la fixation mécanique du tissu telle que publiée ailleurs ^6,9 est susceptible d'interférer avec l'imagerie par microscopie intravitale.

Dans un foie en bonne santé, de 10 à 15% du volume total de sang réside dans le système vasculaire du foie, et l'organe reçoit l'ordre de 25% de la production globale cardiaque ^10, rendant l'organe très sensible aux variations de la circulation (par exemple, les fluctuations de la pression artérielle ). Par conséquent, les perturbations dans le flux sanguin hépatique due à par exemple, contrainte de cisaillement, de déplacement, de blessure par une manipulation excessive des tissus ou la circulation centralisée seront conduire à des altérations artificielles dans leucocytes comportement migratoire, troubles de l'oxygénation du foie et donc également des dommages au foie, affecter les réponses immunitaires du foie ainsi comme conservation d'organes et de la durée de vie globale de l'animal.

Études microscopiques étaient fondés sur km à épifluorescence intravitalecroscopy, mais plusieurs contraintes techniques telles que le blanchiment photo et une faible profondeur de pénétration limiter l'utilisation de cette technique pour le long terme imagerie du foie ^4,11,12. Avec le développement de la microscopie multiphotonique dans les années 1990, les limites de la photo blanchiment ou la profondeur de pénétration ont principalement été résolus, que cette nouvelle méthode était techniquement capable d'effectuer des études d'imagerie dans pratiquement tous les organes dans des situations de la vie réelle ^{de 13 à 15.} Toutefois, les principaux défis à relever en ce qui concerne l'imagerie du foie étaient: mouvements de respiration, autofluorescence des tissus du foie, de fixation flux sanguin inchangée dans les sinusoïdes hépatiques, et l'imagerie particulièrement stable pour des périodes de plusieurs heures ¹⁶ plus longues.

Bien que plusieurs études ont abordé la fonction et la migration des différents leucocytes dans le foie, par exemple, ¹⁷ cellules NKT ^18-20, les cellules T ^21,22, les macrophages du foie ^23,24 ou ²⁵ neutrophiles, long terme multiphotonique mimagerie icroscopy ne avait pas encore été établie avec succès, une tâche encore plus difficile chez les animaux atteints de maladie hépatique aiguë ou chronique en raison des dommages existants et la susceptibilité donc supérieur à ²⁶ autres dommages. Toutefois, le suivi du comportement migratoire et la fonction cellulaire de leucocytes dans le foie en temps réel permet de nouvelles perspectives dans leur rôle particulier dans l'homéostasie du foie et la maladie ^27.

Le CXCR6 des récepteurs de chimiokines est exprimé sur plusieurs sous-ensembles de lymphocytes, y compris les cellules tueuses naturelles (NK), les cellules NKT et certaines populations de cellules T ^18,28. Des études antérieures sur des souris ont indiqué que CXCR6 et son CXCL16 de ligand apparenté peuvent contrôler les patrouilles des cellules NKT sur sinusoïdes du foie lors de l'homéostasie. Par conséquent, l'utilisation de souris CXCR6.gfp (portant un knock-in de la protéine verte fluorescente [GFP] dans le locus CXCR6) a été décrite pour étudier la migration des lymphocytes dans divers organes tels que le cerveau ²⁹et aussi le foie ^18,20, montrant l'infiltration de cellules CXCR6.gfp augmenté sur l'inflammation.

Avec la méthode prévue dans cette étude, il était possible de suivre ces processus sur une longue période de temps dans des conditions stables. La procédure basée multiphotonique intravitale permis imagerie qui était très reproductible avec une perturbation minimale de l'animal et l'organe; optimisé pour la survie des animaux à long terme par une surveillance importante suivie d'un contrôle étroit de la respiration et de la circulation; et très flexible et facile à adopter aussi à d'autres organes parenchymateux tels que le rein ou de la rate.