Yüksek frekanslı Ultrason Kullanımı Fare Embriyolar Kontrast Görüntüleme
Summary
Burada, biz yaşam içine ultrason mikrokabarcık kontrast maddeler, izole geç gebelik sahne kemirgen embriyolar enjekte etmek için bir protokol mevcut. Bu yöntem perfüzyon parametrelerinin ve kontrastlı yüksek frekanslı ultrason görüntüleme kullanılarak embriyo içinde vasküler moleküler belirteçlerin çalışma sağlar.
Abstract
Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or αvβ3) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.
Introduction
Kontrastlı ultrason görüntüleme görselleştirmek ve damar ortamı karakterize etmek kabarcık kontrast maddelerin kullanımını kolaylaştırır. Bu ajanlar mikrosirkülasyon, damarlanma ve kardiyovasküler fonksiyonu noninvaziv değerlendirmesini sağlar. Buna ek olarak, baloncuk yüzeyinin modifikasyonu mümkün vasküler olay moleküler ultrason görüntüleme yapmak anjiyojenez, ateroskleroz ve inflamasyon 1,2 klinik öncesi uygulamalarda gösterildiği gibi, endotelyal biyolojik bağlanma hedeflenen mikro-sonuçlanabilir. Kontrastlı ultrason nedenle de sağlıklı ve hastalıklı damar durumları 3-5 etkileyen karmaşık ve çeşitli ortamlar belirlemek için kullanılabilir.
Yıl geçmiş sayıda, kabarcık görüntüleme programı ilgi yönlü fare embriyo modeli genişletmiştir. Memeli bir gelişme modeli olarak, embriyonik damar içine kabarcıkların giriş fizyolojik artırırGelişmekte olan dolaşım sistemi (örneğin, kan akımı, kardiyak output) ve transgenik durumlarda ve kalp hastalığı 6,7 hedeflenen mutant fare modellerinde, çalışma kardiyovasküler fonksiyonu nasıl değiştirdiğini genetik faktörler anlayışlar verebilir. Aslında, nicel ve nitel 2D embriyonik beyin damar analizleri zaten 8 elde edilmiştir. Bundan başka, fare embriyosu canlı dokuda vasküler belirteçlerle hedeflenen mikro-kabarcıklar bağlanmasının incelenmesi için mükemmel bir model olarak sunulur. Bartelle ve diğ. 9, örneğin, Biotag-BirA transgenik embriyo bağlanma ve damar anatomisinin incelemek hedeflenen değerlendirir embriyo kalp ventriküllere, avidin mikro-kabarcıkları getirmiştir. kliniğe Bu teknik çeviri önemli bir kriter – heterozigot ve homozigot fare modelleri üretimi de moleküler ultrason kantitatif tabiatının belirlemek amacıyla yapılan tümör modeli araştırmaları için bir vekil olarak kullanılabilir edilebilir.
<p clgöt = "jove_content"> mikro-en sık laparotomi 8-10 aracılığıyla maruz tek embriyo içi kardiyak enjeksiyonlar aracılığıyla embriyonik dolaşıma tanıtıldı. utero enjeksiyonları Ancak, bir takım zorluklarla karşı karşıya. Bu enjeksiyon rehberlik, anne ve batın embriyo hareketi karşı ihtiyacını, anne hemodinamik canlılığının bakım ve 11 kanama nedeniyle anestezi ve komplikasyon uzun vadeli etkileri ele batın embriyolar içerir. Bu nedenle, soruşturmanın amacı izole yaşayan geç evre embriyoların 12 içine mikrokabarcıkları enjekte için bir teknik geliştirmek oldu. Bu seçenek, enjeksiyon kontrol ve konumlandırma, tıkanma olmadan görüntüleme uçağın tekrarlanabilirlik ve basitleştirilmiş görüntü analizi ve ölçümü açısından daha fazla özgürlük sunuyor.Bu çalışmada, biz fo yaşayan kemirgen embriyolara kabarcıkların enjeksiyon için yeni bir prosedür anahatr kabarcık kinetik davranışları okuyan ve amaçları endojen endotel yüzey belirteçleri bağlayıcı Kabarcığa hedeflenen Derslerinizi. Lineer olmayan bir kontrast özel ultrason görüntüleme tepe geliştirilmesinde uygulanmıştır (PE), yıkama-oranı ve süresi izole E17.5 embriyolar (TTP) tepe dahil olmak üzere temel perfüzyon bir dizi parametre ölçülmesi için kullanılır. Bu, aynı zamanda, aktif bir anjiyojenez 13 bölgelerinde damar endotel hücrelerinde yüksek ifade için endoglin klinik olarak anlamlı bir hedef işlev transjenik fare modeli, bir embriyonik endoglin kaybına moleküler ultrason kantitatif tabiatının değerlendirmek için embriyo modelinin geçerliliğini göstermek . endoglin hedefli (MB E) fare izotip IgG2 kontrol (MB C) ve hedefsiz (MB U) mikro-kabarcıkların yapışma heterozigot endoglin (İngilizce +/-) ve homozigoz endoglin (İngilizce + / +) sentezleyen embriyolar değerlendirilir. Hedeflenen bindinin analizing moleküler ultrason endoglin genotipleri arasında ayırt ve ölçülebilir moleküler ultrason seviyelerine reseptör yoğunlukları ilgili yeteneğine sahip olduğunu ortaya koymaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ultrason kontrast ajanlar geç evre gebelik fare embriyoları ve doğrusal olmayan kontrast görüntüleri enjekte edildi perfüzyon parametreleri ölçmek için edinilen ve bağlayıcı Kabarcığa hedef alındı. Embriyonik damar sistemi içerisinde mikro-kabarcıkların başarılı görüntüleme bir dizi faktöre, ilk olarak embriyo canlılığı bağımlıydı. Tüm ekipman ve cihaz enjeksiyonun başlangıcında rahim embriyoların izolasyonu için gerekli olan zamanı en aza indirmek için önceden hazırlanmışt…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Terry Fox Program of the National Cancer Institute of Canada.
Materials
| Reagents | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Antibodies (biotinylated, eBioscience) | Antibody choice depends on the experiment | ||
| rat isotype IgG2 control | eBioscience | 13-4321-85 | This antibody/microbubble combination is often required as experimental control |
| biotin anti-mouse CD309 | eBioscience | 13-5821-85 | |
| Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin | In house hybridoma | Outside antibodies may also be appropriate: we have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past | |
| Distilled water | |||
| Embryo media | |||
| 500 mL Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose | Sigma | D5796 | |
| 50 mL Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | lot # 7592456 |
| Hepes | Gibco | 15630 | 5mL, 1M |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 5 mL, 10,000 units Pen., 10,000 ug Strep |
| Ethanol, 70% | |||
| Ice | |||
| Paraformaldehyde | Sigma | 76240 | 4% |
| Phosphate Buffered Saline [1x] | Sigma | D8537 | 1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride |
| Pregnant mouse, CD-1 | Charles River Laboratories Inc. | ||
| 0.9% sodium chloride (saline) | Hospira | 0409-7984-11 | |
| Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted | MicroMarker; VisualSonics Inc. | ||
| Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) | CSP Medical | 133-1009 | |
| Equipment | |||
| Cell culture plates (4) : 100×20 mm | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| Cell culture plates (12) : 60×15 mm | Sigma | D8054 | |
| Centrifuge | Sorvall Legend RT centrifuge | ||
| Conical tubes, 50 mL BD Falcon | VWR | 21008-938 | |
| Diluent | Beckman Coulter | Isoton II Diluent, 8448011 | |
| Dissection scissors (Wagner) | Fine Science Tools | Wagner 14068-12 | |
| Forceps (2), Dumont SS (0.10×0.06 mm) | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Forceps, splinter | VWR | 25601-134 | |
| Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker) | VWR | 89000-216 | |
| Glass capillaries, 1×90 mm GD-1 with filament | Narishige | GD-1 | |
| Glass needle puller | Narishige | PN-30 | |
| Gloves | Ansell | 4002 | |
| Gross anatomy probe | Fine Science Tools | 10088-15 | |
| Hot plate | VWR | 89090-994 | |
| Ice bucket | Cole Parmer | RK 06274-01 | |
| Imaging Platform | VisualSonics Inc. | Integrated Rail System | |
| Light source, fiber-optic | Fisher Scientific | 12-562-36 | Ideally has adjustable arms |
| Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread | Cole Parmer | 45500-30 | |
| Micro-ultrasound system, high-frequency | VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Needles, 21 gauge (1”) | VWR | 305165 | |
| Particle size analyzer | Beckman Coulter | Multisizer 3 Coulter Counter | |
| Perforated spoon (Moria) | Fine Science Tools | MC 17 10373-17 | |
| Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Pipettors [2-20 uL, 20-200uL, 100-1000uL] | Eppendorf | Research Plus adjustable 3120000038; 3120000054; 3120000062 | |
| Pipettor tips [2-200uL, 50-1000uL] | Eppendorf | epT.I.P.S. 22491334; 022491351 | |
| Scissors | |||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| Tubing, Tygon laboratory 1/32×3/32” | VWR | 63010-007 | |
| Wooden applicator stick (swab, cotton head) | VWR | CA89031-270 | |
| Surgical microscope 5-8x magnification | Fisher Scientific | Steromaster | |
| Syringes, 1 mL Normject | Fisher | 14-817-25 | |
| Syringes (10), 30 mL | VWR | CA64000-041 | |
| Syringe infusion pump | Bio-lynx | NE-1000 | |
| Thermometer, -20-110oC | VWR | 89095-598 | |
| Timer | VWR | 33501-418 | |
| Tubes, Eppendorf | VWR | 20170-577 | |
| Tube racks (3) | VWR | 82024-462 | |
| Ultrasound transducer, 20 MHz | VisualSonics Inc. | MS250 | |
| Vannas-Tubingen, angled up | Fine Science Tools | 15005-08 |
Referencias
- Voigt, J. U. Ultrasound molecular imaging. Methods. 48 (2), 92-97 (2009).
- Klibanov, A. Preparation of targeted microbubbles: Ultrasound contrast agents for molecular imaging. Medical Biological Engineering Computing. 47 (8), 875-882 (2009).
- Cosgrove, D., Lassau, N. Imaging of perfusion using ultrasound. European Journal Of Nuclear Medicine And Molecular Imaging. 37 (S1), 65 (2010).
- Williams, R., et al. Dynamic microbubble contrast-enhanced US to measure tumor response to targeted therapy: A proposed clinical protocol with results from renal cell carcinoma patients receiving antiangiogenic therapy. Radiology. 260 (2), 581 (2011).
- Burns, P. N., Wilson, S. R. Focal liver masses: Enhancement patterns on contrast-enhanced Images – Concordance of US scans with CT scans and MR images. Radiology. 242 (1), 162 (2006).
- Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. 40 MHz doppler characterization of umbilical and dorsal aortic Blood flow in the early mouse embryo. Ultrasound. In Medicine And Biology. 26 (8), 1275-1283 (2000).
- Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. Spatial velocity profile in mouse embryonic aorta and doppler-derived volumetric flow: A preliminary model. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H908-H916 (2002).
- Aristizábal, O., Williamson, R., Turnbull, D. H. . 12A-4 in vivo 3D contrast-enhanced imaging of the embryonic mouse vasculature. Paper presented at Ultrasonics Symposium. , (2007).
- Bartelle, B. B., et al. Novel genetic approach for in vivo vascular imaging in mice. Circ.Res. 110 (7), 938-947 (2012).
- Endoh, M., et al. Fetal gene transfer by intrauterine injection with microbubble-enhanced ultrasound. Molecular Therapy. 5 (5), 501-508 (2002).
- Yamada, M., Hatta, T., Otani, H. Mouse exo utero development system: Protocol and troubleshooting. Congenital Anomalies. 48 (4), 183-187 (2008).
- Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Hudson, J. M., Purin, M. C., Foster, F. S. VEGFR2-targeted molecular imaging in the mouse embryo: An alternative to the tumor model. Ultrasound in medicine and biology. 40 (2), 389-399 (2014).
- Paauwe, M., Dijke, t. e. n., P, L. J. A. C., Hawinkels, Endoglin for tumor imaging and targeted cancer therapy. Expert Opinion On Therapeutic Targets. 17 (4), 421-435 (2013).
- Bourdeau, A., Faughnan, M. E., Letarte, M. Endoglin-deficient mice, a unique model to study hereditary hemorrhagic telangiectasia. Trends Cardiovasc. Med. 10 (7), 279-285 (2000).
- Whiteley, K. J., Adamson, S. L., Pfarrer, C. D. Vascular corrosion casting of the uteroplacental and fetoplacental vasculature in mice. Placenta And Trophoblast: Methods And Protocols. 121 (121), 371-392 (2006).
- Kulandavelu, S., et al. Embryonic and neonatal phenotyping of genetically engineered mice. ILAR Journal. 47 (2), 103-10 (2006).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. 85, (2014).
- Willmann, J. K., et al. Targeted contrast-enhanced ultrasound imaging of tumor angiogenesis with contrast microbubbles conjugated to integrin-binding knottin peptides. The Journal of Nuclear Medicine. 51 (3), 433-440 (2010).
- Deshpande, N., Ren, Y., Foygel, K., Rosenberg, J., Willmann, J. K. Tumor angiogenic marker expression levels during tumor growth: Longitudinal assessment with molecularly targeted microbubbles and US imaging. Radiology. 258 (3), 804-811 (2011).
- Lyshchik, A., et al. Molecular imaging of vascular endothelial growth factor receptor 2 expression using targeted contrast-enhanced high-frequency ultrasonography. Journal Of Ultrasound In Medicine. 26 (11), 1575-1586 (2007).
- Jerkic, M., et al. Endoglin regulates nitric oxide-dependent vasodilatation. The FASEB Journal. 18 (3), 609-611 (2004).
- Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Lee, J. J. Y., et al. . Contrast-Enhanced Molecular Ultrasound Differentiates Endoglin Genotypes in Mouse Embryos. , (2014).
- Adamson, S. L., Lu, Y., Whiteley, K. J., et al. Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta. Dev Biol. 250, 358-35 (2002).
- Needles, A., et al. Nonlinear contrast imaging with an array-based micro-ultrasound system. Ultrasound. Medicine Biology. 36 (12), 2097 (2010).
- Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology. 20 (3), 180-193 (2005).
- Shalaby, F., Rossant, J., Yamaguchi, T. P., et al. Failure of blood-island formation and vasculogenesis in Flk-1-deficient mice. Nature. 376, 62-66 (1995).
- Kwee, L., Baldwin, H. S., Shen, H. M., et al. Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice. Development. 121, (1995).
- Mercurio, A. M. Lessons from the α2 integrin knockout mouse. The American journal of pathology. , 161-163 (2002).
- Hodivala-Dilke, K. αvβ3 integrin and angiogenesis: a moody integrin in a changing environment. Curr Opin Cell Biol. 20, 514-519 (2008).
- Pysz, M. A., Gambhir, S. S., Willmann, J. K. Molecular imaging: current status and emerging strategies. Clinical radiology. 65, 500-516 (2010).
- Cybulsky, M. I., Iiyama, K., Li, H., et al. A major role for VCAM-1, but not ICAM-1, in early atherosclerosis. J Clin Invest. 107, 1255-1262 (2001).
- Xu, H., Gonzalo, J. A., St Pierre, ., Y, , et al. Leukocytosis and resistance to septic shock in intercellular adhesion molecule 1-deficient mice. J Exp Med. 180, 95-109 (1994).
- Gerwin, N., Gonzalo, J. A., Lloyd, C., et al. Prolonged eosinophil accumulation in allergic lung interstitium of ICAM-2-deficient mice results in extended hyperresponsiveness. Immunity. 10, 9-19 (1999).
- Johnson, R. C., Mayadas, T. N., Frenette, P. S., et al. Blood cell dynamics in P-selectin-deficient mice. Blood. 86, 1106-1114 (1995).
- Corrigan, N., Brazil, D., McAuliffe, F. High-frequency ultrasound assessment of the murine heart from embryo through to juvenile. Reproductive Sciences. 17 (2), 147-14 (2010).
- Turnbull, D. H., Bloomfield, T. S., Baldwin, H. S., Foster, F. S., Joyner, A. L. Ultrasound backscatter microscope analysis of early mouse embryonic brain development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 2239-2243 (1995).
- Greco, A., Mancini, M. L., Gargiulo, S., et al. Ultrasound Biomicroscopy in Small Animal Research: Applications in Molecular and Preclinical Imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, (2012).
- Pysz, M. A., Guracar, I., Foygel, K., Tian, L., Willmann, J. K. Quantitative assessment of tumor angiogenesis using real-time motion-compensated contrast-enhanced ultrasound imaging. Angiogenesis. 15, 433-442 (2012).
- Larina, I. V., et al. Live imaging of blood flow in mammalian embryos using doppler swept-source optical coherence tomography. J.Biomed.Opt. 13 (6), 060506-06 (2008).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. . Live imaging of mouse embryos. 4 (4), 104-10 (2011).
- Teichert, A., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene expression during murine embryogenesis. Commencement of expression in the embryo occurs with the establishment of a unidirectional circulatory system. Circulation Research. 103 (1), 24-33 (2008).
- Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. Three-dimensional analysis of vascular development in the mouse embryo. PLoS One. 3 (8), (2008).
