We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.
Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.
القيطم المورق هو يستخدم على نطاق واسع، كائن نموذج قوي لدراسة تطوير 1. وذلك لأن البيض القيطم هي كبيرة بشكل غير عادي (حوالي 1،2-1،4 مم، بالمقارنة مع نظرائهم الثدييات يجري حوالي 0.1 مم) وفيرة. البيض يحتوي على توليفها أمهات وتخزينها المكونات، التي تكفي لدفع عجلة التنمية الجنينية حتى منتصف الأريمة الانتقالية (MBT، والتي تحدث في مرحلة 8-8.5 مع 4،000-8،000 خلايا). ويرافق MBT التي كتبها تفعيل الجينوم اقحي، التي تنتج ثم المنتجات الجينات الجنينية التي توجه مزيد من التطوير.
العديد من الدراسات تهدف الى تحديد العوامل الأمهات هامة للتنمية. العديد من الدراسات تعتمد على حقن العقاقير [أليغنوكليوتيد (oligos) بما في ذلك أليغنوكليوتيد] morpholino إلى الأجنة المخصبة، والذي تدهور حالة البروتينات الأمهات يمكن ملاحظة في مرحلة المعيدة 2-4. بدلا من ذلك، يتم حقن من mRNAs لم المخصبةbryos يزعج وظائف الجينات أو لتتبع مصائر البروتينات overexpressed. ومع ذلك، فإن الحقن في الأجنة مرحلة خلية واحدة عادة لا يؤثر على مستويات التعبير من البروتينات الأمهات في المراحل الجنينية المبكرة جدا قبل MBT.
أنشئت Heasman وايلي طريقة نقل المضيف للتغلب على هذه المسألة 5. في طريقتهم، يتم حقن البويضات defolliculated يدويا مع oligos العقاقير ونقلها إلى الإناث المضيف 6. وdownregulated البروتينات قبل الإخصاب بحيث الأدوار من البروتينات downregulated في التطور الجنيني المبكر يمكن فحصها. أدت هذه الطريقة استنزاف الأمهات إلى التعرف على العديد من الأدوار التنموية الفريدة من البروتينات الأمهات، كما استعرضت في 7.
في هذا التقرير، إلا أننا التفاصيل أسلوبنا وضعت مؤخرا، والذي يتحقق استنزاف الأمهات أو overexpression من مرنا قبل الإخصاب دون defolliculation اليدوي ونقل المضيف8. يتطلب دليل defolliculation الكثير من الوقت ونقل المضيف كثيرا ما يحتاج تقنيات ماهرا وترخيص محدد لجراحة الحيوان، مما يعوق كثرة استخدام أسلوب استنزاف الأمهات. يتم استبدال Defolliculation ونقل المضيف عن طريق defolliculation الأنزيمية 9،10 وداخل الهيولى حقن الحيوانات المنوية (الحقن المجهري) 11-13 على التوالي. الحقن المجهري للبيض كانت في الأصل تستخدم لإنتاج الضفادع المعدلة وراثيا 12. وقد تم زرع الحيوانات المنوية والأجنة نوى أيضا إلى البويضات في المختبر البرمائيات نضجت 11،14،15. هنا، وتبين لنا طريقة لدينا خطوة بخطوة لحقن الحيوانات المنوية في المختبر لالبويضات الناضجة التي كانت قبل حقن مع oligos العقاقير أو مرنا.
نحن هنا بالتفصيل طريقة جديدة لاستنزاف العوامل الأمهات أو بإفراط عن عوامل خارجية قبل الإخصاب. يتطلب هذا النظام اثنين من إبر دقيقة جدا، ولكن بدلا من ذلك يتخطى عملية جراحية من الضفادع، وتستخدم في طريقة نقل المضيف 7،17. فمن الأمثل لإزالة خطوة عملية جراحية ضفدع من حيث رعاية الحيوان. وعلاوة على ذلك، فإننا لا يجب أن تأخذ بعين الاعتبار لجودة الضفادع المضيف الأنثى لنقل التجارب، وهذا يعني أننا يمكن التخلص من عامل بيولوجي واحد أن يؤثر على نجاح التجارب. لذلك في هذا النظام نوعية البويضات التي تم الحصول عليها من الضفادع PMSG معبي هي عامل رئيسي البيولوجي التي هي مفتاح للتجارب الناجحة. نوعية البويضات يمكن الحكم بعد جمع defolliculation المبيض أو بعد. إذا لوحظ أي خلل في هذه المراحل، فمن الأمثل لجمع المبيض آخر من الضفادع جديد. نقطة أخرى عندما يمكنك التحقق من جودة البويضة هي بعد نضوج البويضة. إذا كانت أقل من 80٪ من progesteronتظهر البويضات المعالجة الإلكترونية علامات النضج، قد لا تكون قادرة على الحصول على عدد كاف من الأجنة لمزيد من التحليلات. استخدام defolliculation الأنزيمية بدلا من defolliculation اليدوي هو أيضا ميزة أخرى لاستخدام هذا النظام للحد من العمالة المطلوبة لdefolliculation. ومع ذلك، فإنه لا يزال من الممكن أن defolliculation اليدوي قد يعطي تطور أفضل من العلاج الأنزيمية.
كما هو مبين في الشكل (3)، ما يقرب من 10٪ من البويضات في المختبر نضجت يمكن أن تصل إلى مرحلة الشرغوف السباحة. يتم جمع هذه البيانات من 13 تجارب مستقلة بما في ذلك تلك التي أعلن عنها في 8 و التجارب الجديدة الحقن. يحتاج أسلوب نقل المضيف 75-150 البويضات في كل معاملة للحصول على بيانات ذات مغزى منذ 30-60٪ من البويضات نقل يمكن أن تصل إلى المرحلة العصيبة 17. أسلوبنا يبدأ عادة مع 200-300 البويضات في كل مجموعة التجريبية منذ ما يقرب من 40-60٪ من الأجنة المشقوق يمكن أن تصل إلىمرحلة استجابة العضلات. وتشير هذه البيانات إلى أن كلتا الطريقتين تدعم معدل التنموي معقول. لقد حصلنا حتى الآن 10 الضفادع على قيد الحياة من السيطرة حقن مرنا والسيطرة العقاقير البويضات حقن بنسبة ضئيلة باستخدام هذه التقنية، مشيرا إلى أن هذا النهج يدعم التنمية من خلال التحول.
ويقدم لنا بويضة طريقة التلاعب-ICSI فرصة لاختبار دور العوامل الأمهات أثناء التطور الجنيني المبكر جدا، بعد وقت قصير من الإخصاب. وبالإضافة إلى ذلك، overexpression من العوامل الكروماتين المغيرة قبل الإخصاب قد تجعل من الممكن لإعادة الكروماتين الأم قبل الإخصاب لفهم الدول لونين الأمهات اللازمة لنمو. ويجوز لهذه الاستراتيجية أيضا تعمل بشكل جيد مع الحالية وتحرير الأنظمة الجينات مثل النسخ، مثل المنشط المستجيب نوكلياز (TALEN) 18،19 وكريسبر / CAS9 20،21 منذ يمكن التعبير عنها حتى قبل الإخصاب هذه. لذا، نهجنا الجديد لديه potentiالقاعدة لاستخدامها في العديد من التطبيقات في المستقبل.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to Gurdon laboratory members for useful discussion. K.M. is a Research Fellow at Wolfson College and is supported by the Herchel Smith Postdoctoral Fellowship and the Great Britain Sasakawa Foundation. Gurdon laboratory is supported by grants from the Wellcome Trust (RG69899) and MRC to J.B.G.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | MSD Animal Health | Vm 01708/4309 | PMSG-Intervet 5000iu powder and solvent for solution for injection |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS222) | Sigma | A5040 | For anesthesia |
Liberase TM Research Grade | Roche | 05 401 127 001 | For oocyte defolliculation. Store at -20oC |
Drummond Nanoject | Drummond Scientific Company | 3-000-205/206 | For microinjection |
glass capillary | Alpha laboratories | 7” Drummond #3-000-203-G/XL | For microinjection |
Micropipette Puller | SUTTER Instrument | Model D-97 | For microinjection |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | For invitro maturation and ICSI |
14 ml ultra-clear centrifuge tube | Beckman Coulter United Kingdom Ltd | 344060 | For sperm purification |
OptiPrep Density Gradient Medium (Iodixanol) | Sigma | D1556 | For sperm purification |
Digitonin | Sigma | D141 | Cell permeabilization reagent |
Shaker | Hybaid | HB-SHK-1 | For oocyte defolliculation. |
Dissecting microscope (Stereo zoom microscope) | ZEISS | Semi SV6 | For oocyte collection and microinjection |
50 μm pore filter | CellTrics | 04-0042-2317 | For sperm purification |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100XP | For sperm purification |
50 ml centrifuge tube | Cellstar Greiner Bio-One | 227261 or 210261 | Oocyte collection and defolliculation reaction |
15 ml centrifuge tube | FALCON | 352097 | For sperm purification |
90 mm Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20/C | |
Easy-Grip Cell Culture Dish, 60×15 mm | FALCON | 353004 | |
Easy-Grip Cell Culture Dish, 35×15 mm | FALCON | 351008 |