La manipulación y<em> In Vitro</em> La maduración de<em> Xenopus laevis</em> Los ovocitos, seguido de inyección intracitoplasmática de espermatozoides, para estudiar el desarrollo embrionario

NOTA: Todos los experimentos con ranas se realizó siguiendo los requerimientos del Ministerio del Interior británico. 1. Preparación de oocitos de Xenopus laevis Aproximadamente una semana antes de la recolección de los ovocitos, inyectar ranas femeninas con 150 U de yegua preñada de gonadotropina sérica (PMSG) para pre-cebado utilizando 1 ml jeringa estéril con una aguja de 27 G. La inyección se realiza por vía subcutánea en saco linfático dorsal. NOTA: Es óptimo utilizar ranas que no ponen huevos durante mucho tiempo (por lo menos más de la mitad de año) o que nunca han puesto huevos antes. Tienda ranas pre-ceba en un tanque de agua regulado a 18 ° C en la sala de control de luz (07 a.m.-7 p.m.: on, 7 p.m.-07 a.m.: off). En el día de la recogida de ovocitos, preparar 1 l de 1x modificados Solución de Barth (MBS) de 10x MBS de stock de diluir con agua destilada dos veces (ddH 2 O), y añadir penicilina y estreptomicina a la concentración final de 10 mg / mlcada uno (MBS + PS). 10x MBS Stock consta de NaCl 880 mM, KCl 10 mM, 24 mM de NaHCO3, 8,2 mM MgSO 4 .7H 2 O, 3,3 mM Ca (NO 3) 2 .4H 2 O, 4,1 mM CaCl 2 .6H 2 O, 100 mM HEPES, pH 7,5. Anestesiar una rana pre-cebado por inyección subcutánea de 120 mg (en 400 l) de metanosulfonato de tricaína (MS222). Mantenga la rana inyectado en un pequeño tanque con agua. Después de 10 minutos, comprobar la rana anestesiado por haberle dado la vuelta ya con éxito ranas anestesiados no responden a este. Si la anestesia es incompleta, añadir hielo en el tanque y esperar a que otro 10 min. Recoge la rana desde el pequeño tanque y colocar en decúbito dorsal en un húmedo del paño. Con unas pinzas y unas pequeñas tijeras quirúrgicas, pellizcar la piel y hacer una pequeña incisión (2 cm) en la parte inferior del abdomen, lateral a la línea media. Haz otra incisión en el otro lado. Después de cortar la piel, levantar el wi capa muscularfórceps º y hacer la incisión en la capa muscular. Observe el ovario después se corta la capa muscular y tire el ovario hacia fuera de las incisiones utilizando fórceps. Transferencia extrajo ovario a un tubo de 50 ml con solución de MBS. NOTA: Trata de recoger la mayor cantidad posible de ovario dos incisiones. Masacre la rana hembra por desangrado, seguido de congelación para su posterior eliminación. Enjuague el ovario se extrae varias veces con MBS + PS hasta que la sangre se elimina por lavado. A continuación, transferir el ovario a una placa de Petri de 9 cm que contiene MBS + PS NOTA: Compruebe la calidad de los ovocitos en un microscopio de disección en este punto. Si ovocitos son aparentemente mala calidad, tales como ovocitos con pigmentación desigual en el medio de los animales (Figura 1A), no procesar aún más y en lugar de obtener una nueva ovario. Idealmente, los oocitos deben tener hemisferios animales igualmente pigmentadas y ser aproximadamente de igual tamaño. Se burlan de ovario en trozos pequeños(1-2 cm 2) y recoger 5 ml de ovocitos en un nuevo tubo de 50 ml. Enjuague 5 ml de ovario desgarrado un par de veces con MBS + PS y añadir MBS + PS a 15 ml. Añadir 7 unidades de la enzima para defolliculation a la suspensión de ovario (ver Lista de Materiales). NOTA: Reconstituir enzima liofilizado con 10 ml de ddH 2 O (28 unidades / ml). Colocar el vial durante 30 min en hielo con agitación suave ocasional. Alícuota de 250 l y almacenar a -80 ° C hasta su uso. Incubar la pieza de ovario con la enzima durante 1 hora con agitación suave en el agitador (velocidad a la 15 REV / min, equivalente a aproximadamente 0.014 xg). NOTA: Para la eliminación casi completa de las células del folículo, 2 horas a 2 horas 15 minutos de incubación con normalmente se necesita la enzima. Se necesita más tiempo de incubación para la transferencia nuclear de ovocitos experimento 16. Después de 1 h de incubación, recoger un pequeño número de ovocitos tratados (10-20 ovocitos) y la transferencia a un plato de 6 cm de Petri que contiene MBS + PS Compruebe el extent de defolliculation bajo un microscopio de disección. Si ovocitos se separan uno de otro y al menos parcialmente desfolicularon (Figura 1B), proceder inmediatamente a la siguiente reacción de parada (paso 18). Si ovocitos son todavía muy rodeados de células del folículo, se incuba durante 15 min extra al máximo. Añadir un montón de MBS + PS para detener la reacción y descartar el sobrenadante. Repita el lavado durante 10 veces. NOTA: Añadir MBS + PS vertiendo a la pared de un tubo de 50 ml, pero no directamente a los ovocitos. Después de la suspensión en MBS + PS, pequeñas ovocitos inmaduros tienden a flotar en la parte superior de tampón de lavado y desechar dichos ovocitos flotantes pequeños. Después de los lavados, la transferencia a una placa de Petri de 9 cm que contiene MBS + PS NOTA: A partir de este paso adelante, mantener ovocitos en 16-18 ° C tanto como sea posible. Esto puede hacerse manteniendo el plato que contiene ovocitos en un escenario de temperatura controlada. Seleccione la etapa VI ovocitos según la clasificación de Dumontpara usos posteriores y la transferencia a un nuevo 9 cm placa de Petri que contiene MBS + transferencia de ovocitos PS se puede hacer mediante el uso de una pipeta de vidrio con un tamaño de la punta adecuada (más grande que el tamaño de los ovocitos). NOTA: los ovocitos de buena calidad debe tener un hemisferio animales uniformemente pigmentada con un claro contraste entre el hemisferio animal y el hemisferio vegetal, y ser aproximadamente del mismo tamaño (Figura 1C). Escenario VI ovocitos representan ovocitos que puedan responder a la progesterona totalmente desarrollados (diámetro de los ovocitos es aproximadamente 1.2 hasta 1.4 mm). 2. La inyección de oligonucleótidos antisentido o ARNm en oocitos NOTA: Todos los pasos de esta sección se deben hacer en 16 a 18 ° C en una platina del microscopio equipado con circulación de agua de temperatura controlada o en una caja de plástico llena de hielo. Transferencia 200-300 ovocitos seleccionados en una nueva placa de Petri de 9 cm lleno de MBS + PS, en el que se realizará la microinyección. NOTA: En each condición, se utilizan normalmente 200-300 oocitos. En total, aproximadamente 1.000 ovocitos se utilizan en un experimento. Para la preparación de la inyección de oligonucleótidos antisentido o ARNm, expulse el émbolo de metal de un microinyector. Llene un capilar de vidrio con aceite mineral utilizando jeringa e inserte el capilar de vidrio lleno de aceite al pistón de metal de microinyector. NOTA: Un capilar de vidrio se tira por el extractor micropipeta. Estas agujas se mantienen en una caja sin dañar consejos. Cortar la punta de la aguja utilizando pequeñas tijeras quirúrgicas en el microscopio y el objetivo como Punta de diámetro pequeño para la inyección posible. NOTA: La aguja de punta puede afilarse mediante el uso de un micro forja o micropipeta biselador. Para inclinar la aguja en un ángulo de 25 ° mejora la capacidad de penetrar la pared de ovocitos. Coloque una pequeña tira de Parafilm en el escenario de un microscopio de disección y dispensar una caída de 3 l de la oligo antisentido o solución ARNm. Mueva el tip de la aguja de inyección en la pequeña gota de la solución y llenar la aguja con la solución a inyectar. NOTA: Si la punta de la aguja de inyección es demasiado pequeño, burbujas de aire deben aparecer en la punta del émbolo de metal. Luego, haga una propina más grande en la aguja de la inyección hasta que esto no suceda. Marque la aguja de inyección de aproximadamente 0,5 mm de distancia de la punta. Esta marca se utiliza como un indicador de la profundidad de inyección. Inserte la punta de la aguja en un ovocito lo largo del límite ecuatorial apuntando al punto central del ovocito (debajo de la vesícula germinal) mientras sostiene suavemente el lado opuesto del ovocito hasta el punto de la inyección con una pinza para impedir el movimiento de los ovocitos no deseable durante la inyección . NOTA: Encuentra el área libre de células del folículo (Figura 1 B) e inserte la aguja de ese lugar ya que incluso una aguja fina no puede penetrar a menudo una capa de células foliculares. Expulsar 4,6 ng / nl 4.6 o 9.2 ng / 9,2 nl de antisoligos entido, o un volumen apropiado de ARNm (250 pg a 13,8 ng) utilizando el conmutador de pedal. Los detalles de la preparación de oligo antisentido se describen en 7. La transferencia de los ovocitos inyectados en un plato de 6 cm Petri llena de MBS + PS suplementado con 0,1% de BSA (medio de incubación de ovocitos y esterilizar la solución utilizando un filtro de 0,45 micras de poro). Incubar los ovocitos en 16 ° C o 18 ° C durante 1-2 días. NOTA: inyectado ovocitos pueden ser sometidos a maduración in vitro varias horas después de la inyección, en cuyo caso la inyección de 4,6 ng oligos antisentido es preferible. Una regla general es que cuanto más corto es el período de incubación, mejor será el posterior desarrollo embrionario. 3. Maduración In Vitro (IVM) de ovocitos En la noche de la maduración de ovocitos experimento, ir a buscar solución progesterona madre (30 mM en etanol) de -80 ° C congelador y disolver precipitados en tem habitacióntura con vórtice ocasional. NOTA: La progesterona valores normalmente se deja a temperatura ambiente durante 30 min a 1 hr. Añadir 5 l de la acción de la progesterona en 50 ml de MBS + PS (medio de maduración, la concentración final de la progesterona en 3 M) y agitar en el agitador durante 30 min a distribuir la progesterona en la solución de la misma manera. Preparar placas de 6 cm de agarosa recubiertos para vitro tratamiento de maduración en. Añadir 1 g de agarosa a 50 ml de 1x MBS sin magnesio y calcio. Disolver agarosa por calentamiento en un horno de microondas. Verter un pequeño volumen de la solución de agarosa para placas de 6 cm para cubrir el fondo de platos. Espere por lo menos durante 30 minutos hasta que la solidificación. NOTA: recubrimiento de agarosa evita la fusión de los ovocitos a los platos. Una vez en ovocitos madurados in vitro están estrechamente unidos a los platos, lo más probable es que los oocitos se activarán por los estímulos que reciben durante el desprendimiento de dishes. Vierta 5-8 ml de medio de maduración a los platos de agarosa-coated y transferir 200-300 ovocitos en cada placas de 6 cm. NOTA: Trate de transferir ovocitos con una cantidad mínima de medio de incubación de los ovocitos. Incubar durante 16 horas a 16 ° C. NOTA: Por ejemplo, iniciar el tratamiento a las 5 pm y terminar a las 9 de la mañana del día siguiente. 4. inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) Esperma congelado Stock preparación NOTA: La siguiente preparación de los espermatozoides se debe hacer antes de empezar la maduración de ovocitos experimento, y las existencias de esperma congelado se mantiene a -80 ° C para la ICSI. Recoge los testículos de una rana macho siguiendo los pasos 1.4 a 1.11, excepto para tirar la grasa y los testículos hacia fuera de las incisiones utilizando fórceps y extracción de los testículos de la grasa. Lavar los testículos en 1x Ringers de Marc Modificado (MMR, NaCl 100 mM, 2 mM KCl, 1 mM MgSO 4, 2 mM CaCl 2, 5 mM HEPES, pH 7,4). Retire una grasad vasos sanguíneos por rodar los testículos lavados en un pañuelo de papel limpio y luego eliminando los vasos sanguíneos restantes utilizando fórceps. Coloque cada testículo en un plato de 3,5 cm de Petri que contiene 1 ml de 1x MMR. Cortar longitudinalmente con tijeras finas, y romper en pequeños trozos con pinzas hasta que no haya piezas grandes se mantienen. Pipeta hacia arriba y abajo usando la punta 1 ml de plástico cuyo extremo está cortado, y la carga 1 ml de la solución de los testículos aplastados en un homogeneizador de vidrio. Homogeneizar ellos por 2-3 golpes y luego se vierte la solución sobre un filtro de poros de 50 micras unido a la parte superior de un tubo de centrífuga de 15 ml. Deje que la solución pase por el filtro. Repita el paso 4.1.7 resuspendiendo el testículo restante cortado en 1 ml de 1x MMR. Finalmente, lavar el homogeneizador un par de veces con 1x MMR y pasarlo por el filtro. Repita los pasos 4.1.5 al 4.1.8 para el otro testículo y piscina dos testículos en un 15 ml tubo de centrífuga. Haga girar las células a 800 xga 46; C durante 20 min. Desechar el sobrenadante y resuspender las células sedimentadas en 2 ml de 1x MMR. A continuación, transferir a un tubo nuevo. NOTA: Asegúrese de que no hay glóbulos visibles están presentes. Preparar un gradiente de paso en un tubo de centrífuga ultra-claro 14 ml. Capa inferior: 4 ml de 30% iodixanol. Segunda capa inferior: 1 ml de 20% iodixanol. Tercera capa inferior: 5 ml de 12% iodixanol. Capa superior: testículo células en 2 ml de 1x MMR. Superposición de los gradientes muy suavemente con una punta de pipeta de 1 ml (superponer lentamente de no perturbar la fase inferior). NOTA: Sólo una capa de 30% iodixanol debería funcionar también para aislar los espermatozoides solamente. Giro en el rotor SW40 usando ultracentrifugación a 10.000 xga 4 ° C durante 15 minutos (desaceleración sin interrupción). Retire con cuidado el tubo de la ultracentrifugación. Confirmar una interfaz entre cada capa del gradiente y el sedimento en la parte inferior. Recoge la fracción de espermatozoides a partir del sedimento. Resuspender el pel espermadejar en 1x MMR para lavado de iodixanol. Centrifugado a 800 xg a 4 ° C durante 20 min. NOTA: Si una gran cantidad de esperma aún permanecen en la suspensión después de la vuelta, volver a girar el sobrenadante a 3.220 xg a 4 ° C durante 20 minutos y poner en común los espermatozoides peletizado. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet de esperma en 1 ml de 1x Nuclear Preparación Buffer (NPB; 250 mM de sacarosa, 0,5 mM espermidina trihidrocloruro, 0,2 mM espermina tetrahidrocloruro, EDTA 1 mM, 15 mM HEPES, pH 7,7) 13. A continuación, traslado a un tubo Eppendorf. Añadir 50 l de 10 mg / ml de solución de digitonina en 1x NPB (polvo Resuspender digitonina en DMSO a 50 mg / ml y congelar alícuotas a -80 ° C. Antes de su uso, diluir la 50 mg / ml de alícuota de 10 mg / ml con 1x NPB. No utilizado 10 mg / ml digitonina puede ser congelado y almacenado a -20 ° C y re-utilizado) a 1 ml de la solución de esperma. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente. Disponibilidad de una tasa de permeabilización mediante tinción con DAPI (0,3 g / ml DAPI como una final de concentración). Si menos del 95% de las células se permeabilized, incubar un poco más. NOTA: A veces, si demasiadas células de esperma se incuban al mismo tiempo (especialmente cuando el esperma se recogen a partir de múltiples testículos), es difícil para permeabilizar, en cuyo caso puede ser necesario añadir una pequeña cantidad adicional de digitonina; por ejemplo, si el 20% de los espermatozoides no se permeabilizan, se añade un 20 l adicional de digitonina. Detener la permeabilización mediante la adición de 10% de BSA a una concentración final del 3%. Haga girar las células a 4 ° C. NOTA: Pruebe la menor velocidad de centrifugación como sea posible, comenzando con 100 g durante 5 min. Si no es suficiente, aumentar la velocidad y / o tiempo. Lavar las células con 0,3% de BSA en 1x NPB y centrifugar a la misma velocidad que en el paso 4.1.22. Mientras tanto, preparar el esperma Almacenamiento Buffer (SSB; 2 ml de 2x NPB, 120 l de BSA al 10%, 1,2 ml en autoclave glicerol, 680 l de H 2 O). Añadir 500 l de SSB a los espermatozoidessedimentar. Pipeta varias veces arriba y abajo para volver a suspender con una punta de corte con el fin de no dañar las células. Permitir que se equilibre la noche a 4 ° C. Pipetear las células arriba y abajo varias veces con una punta de corte. Diluir un par de veces en 10 microlitros 1x MMR o en 1x PBS para contar las células utilizando un hemocitómetro. Congele como alícuotas a 30.000 espermatozoides / l (o superior) directamente a -80 ° C y se almacena a -80 ° C en una sola alícuotas de uso. ICSI de ovocitos madurados in vitro NOTA: Todos los procesos que implican ovocitos se deben hacer a 16-18 ° C. Preparar una pipeta de vidrio para la transferencia de ovocitos madurados. NOTA: La pipeta de vidrio tiene que ser lo suficientemente amplia como para dar cabida a los ovocitos sin apretar. Dieciséis horas después de ovocitos en movimiento al medio que contiene progesterona, la transferencia de ovocitos madurados en una placa de agarosa recubiertas de 6 cm lleno de MBS + PS para el lavado. NOTA: Es importante destacar que, movocitos atured tienen que ser tratados con sumo cuidado. Rough tratamiento de ovocitos puede inducir la activación espontánea antes de la inyección de esperma. Cuente ovocitos madurados al confirmar la aparición de manchas blancas, lo que implica la ruptura de la vesícula germinal (Figura 2). Si la tasa de maduración es inferior al 80%, es poco probable para obtener el número suficiente de sobrevivir embriones para otros análisis. NOTA: El resto de las células del folículo se pelan después de la maduración de ovocitos (Figura 2). Ovocitos de transferencia de MBS de lavado a una nueva placa de 6 cm de agarosa recubiertas de llenado con medio de inyección (Preparar 500 ml: 30 g de Ficoll (6%), 20 ml de 10x MMR y 500 l de 1,000x PS Stock). Incubar al menos durante 30 min antes de iniciar ICSI. Configure el microinyector como se describe en los pasos 2.2 a 2.4. NOTA: El tamaño de la punta de la aguja de inyección se mantiene tan pequeño como sea posible siguiendo el procedimiento descrito en el paso 2.6. El diámetrode la aguja es de 20-40 micras. Para inclinar la punta de la aguja como se describe en el paso 2.4 podría permitir la inyección eficiente. Obtener la alícuota de esperma y diluir la suspensión de esperma de esperma en tampón de dilución (SDB; 250 mM de sacarosa, 75 mM KCl, 0,5 mM espermidina, espermina 0,2 mM, 200 mM HEPES pH 7,5). NOTA: La dilución se puede variar dependiendo de un tamaño de la aguja y así sucesivamente. Diluir 120 veces de los 30.000 espermatozoides / Stock l como un intento inicial y ajustar aún más si es necesario. Coloque una pequeña tira de Parafilm en el escenario de un microscopio de disección. Mezclar la solución inyección de esperma mediante pipeteo y dispensar unos pocos gota l de la solución de esperma. Suck la suspensión de esperma diluido en la aguja, inyectar 4,6 nl en 10 gotas sucesivas que contienen 0,3 mg / ml DAPI en un portaobjetos de microscopio, y contar rápidamente el número de espermatozoides entregado por inyección en un microscopio fluorescente. NOTA: Apunte 1-2 espermatozoides por inyección. Si es necesario, se diluye la solución de la inyección de esperma másy compruebe el número de espermatozoides por inyección de nuevo hasta lograr una concentración deseada. Expulsar la solución inyectable de prueba y llenar una nueva solución de inyección de esperma con una concentración adecuada. Inyectar 4,6 nl de solución de esperma para 100 ovocitos madurados. NOTA: Es importante para inyectar continuamente la solución. En primer lugar determinar el tiempo requerido para la expulsión de 4,6 nl (normalmente 1-2 segundos). Repetir el siguiente proceso; inyectar en un ovocito, espere unos segundos, retire la aguja y se burlan de la inyección en solución inyectable, espere unos segundos, inyectar en un ovocito. Esta inyección continua también evita el bloqueo de la punta de la aguja. Alternativamente, el método que utiliza una bomba 13 podría ser utilizado. Después de aproximadamente 100 inyecciones, expulsan la solución esperma restante y volver a llenar la solución de espermatozoides (usar la misma solución de espermatozoides, pero pipeta arriba y hacia abajo antes de la dispensación). NOTA: Si la aguja no succiona bien solución esperma, cortó la punta de la necesidadle. Si esto no mejora la situación, preparar una nueva aguja. Repetir el proceso de inyección hasta que se inyectan todos los oocitos. NOTA: Si la calidad de los ovocitos es bueno y la inyección se realiza correctamente, la contracción de los ovocitos inyectados se ve dentro de 20 minutos de tiempo de inyección. Mueva los platos inyectados a 16 ° C o 18   ° C incubadora. 4-5 horas después de la inyección, compruebe la tasa de división de embriones ICSI. NOTA: surcos de escisión de los embriones pueden no ser tan claras como las de los embriones fecundados normales. Algunos embriones también muestran divisiones anormales, que pueden ser causados ​​por la inyección de esperma múltiple. Embriones Transferencia de embriones escindidos incluyendo anormalmente escindidos a medio de incubación (Preparar 500 ml: 20 g de Ficoll (4%), 5 ml de 10x MMR y 500 l de 1.000 x PS de valores). Incubar los embriones ya sea en 16   ° C o 18 ° C incubadora durante la noche. A la mañana siguiente, embry transferenciaos a MMR 0,1x y contar sobrevivir embriones. En promedio, aproximadamente el 10% de los ovocitos inyectados con espermatozoides puede desarrollarse a la etapa de natación renacuajo (Figura 3A).