Denne protokol beskriver den primære kultur / co-kultur af muse ovarievæv hjælp ovarier fra neonatale mus og individuelle ovariefollikler fra præpubertale mus. De dyrkningsteknikker støtte udviklingen i en yderst fysiologisk måde tillader undersøgelse af virkningen af ydre midler på æggestokkene, og interaktioner mellem ovariefollikler.
Pattedyr æggestok er sammensat af ovariefollikler, hver follikel bestående af en enkelt oocyt omgivet af somatiske granulosaceller, lukket sammen inden for en basalmembran. Et endeligt pulje af follikler er fastsat under fosterudviklingen, når oocytter i meiotisk anholdelse danner et tæt samarbejde med flade granulosaceller, danner primordiale follikler. Ved eller kort tid efter fødslen, mammale æggestokke indeholder deres levetid forsyning af primordiale follikler, fra hvilket punkt og fremefter der er en stabil frigivelse af follikler i den voksende follikulært pool.
Ovariet er særlig modtagelig for udvikling in vitro med follikler vokser i en yderst fysiologisk måde i kultur. Dette arbejde beskriver kultur af hele neonatale æggestokke indeholder primordiale follikler, og kulturen af individuelle ovariefollikler, en fremgangsmåde, der kan understøtte udviklingen af follikler fra et umodent igennem til preovumæssige fase, hvorefter deres oocyter er i stand til at undergå fertilisering in vitro. Arbejdet beskrevet her anvender dyrkningssystemer at bestemme, hvordan æggestokkene påvirkes ved udsættelse for eksterne forbindelser. Vi beskriver også en co-kultur system, som gør det muligt undersøgelse af samspil, der opstår mellem voksende follikler og den ikke-voksende pulje af primordiale follikler.
Pattedyr æggestok består af en kvindelig levetid levering af oocytter, hver indeholdt i en ovariefollikel. De follikler dannes før fødslen ved hvile, primordial stadium: når follicle pool er etableret, er der en kontinuerlig og gradvis bevægelse af follikler fra ur i den voksende follicle pool. Som follikler begynder at vokse, de udvikler gennem de primære, sekundære, preantral og derefter antrale etaper, indtil de når preovulatory eller Graafsk, scene. Kun oocytter fra præovulatoriske follikler har fuld udviklingsmæssige kompetencer, kunne støtte fosterudviklingen til udtryk, hvis befrugtede.
Ovariet har længe været kendt for at udvikle sig i en yderst fysiologisk måde in vitro. Dette vil sandsynligvis være på grund af hver ovariefollikel indeholder i det cellerne, der er nødvendige for at støtte en oocyt fra umodne stadium (hvorefter det ikke er i stand til at afslutte sin meiotiske deling) igennem til than udviklingsmæssigt kompetente trin (på hvilket tidspunkt det fuldt ud kan støtte færdiggørelsen af meiosen, befrugtning og udvikling af det resulterende embryo til termin).
Den fysiologiske natur æggestok udvikling in vitro har ført til den udbredte anvendelse af ovarie dyrkningsteknikker. Derfor har in vitro-metoder blevet anvendt til at undersøge reguleringen af æggestokkene udvikling, ovarie patologi (fx, at af polycystisk ovariesyndrom, PCOS), undersøgelse af, hvordan æggestokke / oocyter påvirkes af udsættelse for kemikalier, og også med den praktiske formål opnåelse fertilizable oocytter fra primordiale ovariefollikler. Hidtil har det sidste opnået kun bruger musen ovarievæv 1, selv om kultur teknikker, der anvender hårsække fra store pattedyr, herunder mennesker, i høj grad har forbedret i de seneste år 2,3.
Vi beskriver her flere dyrkningsmetoder anvendelse af muse ovarievæv. Den første method bruger hele neonatale mus æggestokke, og støtter dannelsen og tidlig udvikling af primordiale follikler 4. Det andet system understøtter væksten af individuelle, intakte ovariefollikler fra slutningen preantral til den præovulatoriske fase; ved hjælp af denne teknik kan follikler dyrkes enkeltvis eller parvis 5,6. Endelig beskriver vi et co-dyrkningssystem, der kombinerer de to første teknikker i en fremgangsmåde, der tillader undersøgelse af samspillet mellem stigende og primordiale ovariefollikler 7.
Kultur af individuelle intakte ovariefollikler tillader follikelvæksten skal bestemmes fra daglige follicle målinger i kultur periode, mens medium analyse tillader undersøgelse af follikelstimulerende / æggestok hormon produktion. Yderligere væv analyser kan opnås ved en samling af follikler eller ovarievæv i slutningen af kultur, til histologisk / immunohistologiske analyser eller til efterfølgende bearbejdning for eksempel for at opnåmRNA eller proteiner.
Vi beskriver her forskellige dyrkningssystemer, der kan udnyttes til at støtte udviklingen af mus ovariefollikler in vitro, ved anvendelse af hele neonatale æggestokke, der kun indeholder de tidligste follicle stadier, individuelle preantral ovariefollikler og også co-kulturer af de to væv.
Kultur af neonatal mus æggestokke understøtter tidlig æggestokkene udvikling, især follikelvæksten initiering op til den sekundære follikel fase. En række alderen neonatale mus kan anvendes til disse kulturer, afhængigt af de udviklingsmæssige stadier af interesse. Hvis æggestokkene opnås fra nyfødte mus, vil follikel dannelse være på vej, men endnu ikke afsluttet: kultur vil i det mindste delvist understøtte fortsat follicle dannelse efterfulgt af follicle vækst. Alternativt brug af ovarier fra mus omkring fire til fem dage gamle (på hvilket tidspunkt follicle dannelse er allerede komplet) resulterer i kultur af et større antal oprindelige og voksende Follikel 12. Fordelagtige aspekter af den specifikke teknik der er beskrevet her omfatter anvendelse af flydende polycarbonatmembraner, som tillader større iltning af vævet, og kultur i en meget basisk medium bestående af kun aMEM og BSA, undgå brug af udefinerede additiver, såsom serum. Kultur af hele æggestokke synes ikke at understøtte udviklingen ud over det sekundære follikel scenen, med efterfølgende udvikling kræver en ændring i teknik, såsom dissektion af follikelstimulerende granulosa celle-komplekser fra den dyrkede neonatale æggestok 1.
Senere stadier af follikeludvikling kan udvikles in vitro ved at dissekere ud individ, intakte sene præ-antrale follikler, som kan dyrkes til preovulatory etape i kultur og samtidig opretholde deres tredimensionelle struktur. Anvendelse af intakte follikler for denne kultur teknik opretholder forholdet mellem de forskellige follikulære komponenter forekommer in vivo. Thikan anvendes kultur for at opnå oocytter, der kan understøtte befrugtning og efterfølgende fosterudvikling.
Fertilizable oocytter kan også opnås fra muse neonatale æggestokkene under anvendelse af en indledende kultur protokol meget som her beskrevet, efterfulgt af en anden fase, i hvilken oocyt-granulosa celle-komplekser dyrkes in vitro 1. Andre systemer, der anvendes temmelig ofte i dag kulturen af follikler eller ovarievæv, der er indkapslet i et materiale, såsom alginat hydrogel, at yde støtte (se for eksempel Tagler et al. 13). En stor del af fokus i metodeudvikling nu er at forbedre kultur teknikker til æggestokke og hårsække af større pattedyr, med det langsigtede formål at opnå fertilisable oocytter fra primordiale follikler fra en række arter, herunder mennesker.
Til enhver tid, pattedyr æggestokke indeholder hårsække på en afstand af udviklingsstadier, med interactions mellem hårsække påvirker deres regulering. Dette aspekt af ovariefunktion er dårligt forstået og vanskeligt at undersøge in vivo. Den endelige metode er beskrevet her anvender co-dyrkningssystemer til støtte for udviklingen af forskellige stadier af follikler i vitro. Hvis det er nødvendigt, en eller begge væv kan forbehandles in vivo eller in vitro forud for co-kultur. Co-dyrkningssystemer som denne giver en ideel måde til at gennemgå follikelstimulerende follicle interaktioner, for eksempel hvordan dyrkning, antrale follikler påvirker oprindelige follicle pool, aspekter af æggestokkene biologi, der har vist svært indtil nu undersøge.
Hele ovarie kultur teknikker er forholdsvis ligetil, selvom omhyggelig dissektion er nødvendig for at undgå utilsigtet vævsskade. Dissektion af individuelle follikler er en specialiseret teknik, der kræver gentagne praksis før follikler på det rigtige tidspunkt kan dissekeres ud fra æggestokken intakt og ubeskadiget. Det er afgørendeat dissekere ud individuelle hårsække omhyggeligt, eller skade under dissektion protokol kan resultere i hårsækken død under den efterfølgende kultur periode. Hvis follikler er placeret direkte i brønd mikrotiterplader, er det vigtigt kun at anvende ikke-vævskultur behandlede plast, for at minimere udpladning ned af thecal celler på plasten: hvis der anvendes vævskulturbehandlet plastvarer vil folliklerne tillægger bunden af brønden og brud som de vokser. For alle co-kultur arbejde, skal væv anbringes i direkte kontakt med hinanden.
Mediet beskrevet ovenfor til anvendelse i follicle kultur teknik omfatter tilsætning af museserum. Det er muligt at udskifte museserum med føtalt bovint serum, men kun lejlighedsvis partier af sådanne sera vil fuldt ud støtte follikeludvikling til den præovulatoriske fase med batch-prøvning for at identificere egnede kilder. Batch-test af FSH er også tilrådeligt, da den internationale Units hvorved FSH vurderes korrelat kun groft til follikelvæksten in vitro. Hvis der opstår follicle brud rutinemæssigt under dyrkningsperioden, overveje stock ascorbinsyre udskifte den med en frisk batch.
Teknikkerne ikke kræver særligt specialiseret udstyr, bortset dissekere mikroskoper og vævskultur inkubatorer, selvom anvendelse af en laminar strøm-hætte og god steril teknik tillader ovariefollikler skal dyrkes i fravær af antibiotika, som i de her beskrevne metoder. Dette kan være nyttigt for at undgå enhver potentiel skadelig virkning af antibiotika på oocytter, især hvis de skal blive befrugtet efter kultur. Hvis det ikke er muligt at arbejde i et sterilt miljø, er det tilrådeligt at tilsætte antibiotika til dissektion og dyrkningsmedier.
The authors have nothing to disclose.
Work was funded by MRC grant G1002118.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Leibowitz L15 | Invitrogen | 11415049 | |
αMEM | Invitrogen | 22571020 | Supplied as sodium bicarbonate buffered (2200 mg/L) |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | For dissection medium |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3311 | For culture medium |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | For coating glass pipettes |
Mouse serum | – | – | Collected from cardiac puncture |
FSH | Merck Serono | Gonal F | Batch testing is often necessary. Make up stock solution of 1IU/10µl in αMEM and store at -20°C. |
Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4034 | Make up stock of 5mg/ml in αMEM and store at -20°C. |
Silicon oil | VWR | 630064V | Dow Corning Silicone Fluid 200/50cS |
Syringe filters (25mm, 0.2µm) | Greiner | 16532K | Cellulose acetate filter: for filtering larger (> 5mls) volumes of medium. |
Syringe filters (13mm, 0.2µm) | Iwaki | 3032-013 | Cellulose acetate filter: for filtering smaller (< 5mls) volumes of medium |
Syringe filters (25mm, 0.45µm) | Iwaki | 2053-025 | Cellulose acetate filter: for filtering oil. |
Sterile tubes | Greiner | 187261 | |
24 well plate | Greiner | 662160 | |
96 well round bottom plate | Iwaki | 3875-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
96 well flat bottomed well | Iwaki | 3860-096 | Use only non-tissue culture treated plates |
Whatman nucleopore membranes | Camlab | WN/110414 | Use shiny surface up, polycarbonate, 13mm diameter, 8.0µm pore size |
Insulin needles | BD medical supplies | 037-7606 | 0.33mm (29G) +1ml |
Glass embryo dishes | VWR | 720-0579 | Sterilise then warm before use |
Glass pipettes | Fisher Scientific | 10209381 | BSA coated before use |
Gel tips | AlphaLabs | LW1103 | |
Acupuncture needles | Acumedic LTD | 30mmx0.25 Type C | |
Bouin’s fixative | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT5014-120ml | |
1.5 ml polypropylene tubes | Greiner BioOne | 616201 |