Kultur und Co-Kultur von Maus Eierstöcke und Eibläschen

Alle Tier Arbeit wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts unter Lizenz von der britischen Home Office (Projektlizenznummer PPL 60/1726 und 60/4026) durchgeführt. Hinweis: Haus Tiere gemäß UK gesetzlichen Anforderungen in einem 14 Stunden Licht und 10 Stunden Dunkelheit Photoperiode. Verhaltenstierversuche mit Wildtyp-Mäusen C57BL6J, Tau-GFP-Mäuse, die ubiquitäre Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) 8 und Thy1-YFP Mäusen mit gelegentlichen Ausdruck gelb fluoreszierendes Protein (YFP) in einer Untergruppe von neuronalen Zellen 9 haben: sowohl transgenen Linien wurden auf einem C57BL6J Hintergrund gezüchtet. 1. Arbeitsbedingungen und die Vorbereitung der Instrumente Führen Sie alle Medienherstellung, Gewebe Dissektionen und Kulturarbeit in einer Sterilbank, um die Sterilität zu gewährleisten: diese die Anforderungen der Beigabe von Antibiotika in Medien vermeidet. Immer erlauben Medien / Kulturplatten / Embryo Gerichte ins Gleichgewichtfür mindestens 1 Stunde in einem 37 ° C-Ofen (dissection Medium / Embryo Geschirr) oder 37 ° C, 5% CO 2 Inkubator (Kulturmedium und Platten), vor der Verwendung. Genießen Glaspipetten in 0,1% Lösung von Rinderserumalbumin (BSA) für etwa eine Stunde, und dann trocknen lassen. Ziehen Pipetten in der Flamme eines Bunsenbrenners, Biegen der Glas wie Sie dies tun, um fein gezeichneten gebogenen Glaspipetten zu produzieren. Nachdem die Pipette gezogen wird, machen einen sauberen Schnitt mit einem Glasschneider. Ofen bei 160 ° C sterilisieren etwa 45 min. HINWEIS: Im Kaufhaus in dieser Glaspipetten werden benötigt, um die Eierstöcke und die Follikel zu übertragen. 2. Herstellung von Dissection und Kultur Medien Bereiten Dissektion Medium. Man löst 3 mg / ml BSA in Leibowitz L15 Medium und durch einen 0,2 & mgr; m Poren, 25 mm Durchmesser Filter sterilisieren. Neonatal Eierstock Kultur. Medium für neonatale Eierstock Kultur vorzubereiten, machen 1 ml Medium für Bildung und Kulturh Ovar, die kultiviert wird. Man löst 3 mg / ml BSA in α-Minimal Essential Media (& agr; MEM), und durch einen 0,2 & mgr; m Poren, 13 mm Durchmesser filtersterilisieren in ein steriles Röhrchen. Um Platten für neonatale Eierstock Kultur vorzubereiten, 1 ml der Neugeborenen-Eierstock Kulturmedium in jede Vertiefung (ein Eierstock pro Vertiefung) einer 24-Well-Platte. Mit einer sterilen Uhrmacher Pinzette, legen Sie eine Polycarbonatmembran über dem Medium in jedem Well, glänzende Oberfläche auf. UV sterilisieren Membranen vor der Verwendung. Follikel-Kultur. Medium für Follikel Kultur vorzubereiten, zu ergänzen, α-Minimal Essential Media mit 1 IU / ml rekombinantes humanes Follikel-stimulierendes Hormon, 5 ug / ml Ascorbinsäure und 5% v / v Serum von erwachsenen weiblichen Mäusen erhalten. Filter sterilisiert durch einen 0,2 & mgr; m Poren, ø 13 mm-Filter in ein steriles Röhrchen. Filter sterilisieren Silikonöl durch einen 0,45 & mgr; m Poren, Durchmesser 25 mm Filter, in ein steriles Röhrchen. Um pla vorbereitentes, werden 30 & mgr; l Tröpfchen der Follikel Kulturmedium in jede Vertiefung einer nicht-Gewebekultur behandelten 96-Well-Mikrotiter-Rund-Well-Platte, die nur die obere Reihe jeder Platte (damit Follikel in neuen Zeilen pro Tag über bewegt werden Die Kulturzeit). Sorgfältig überlagern Medium mit 70 ul sterilisiertes Silikonöl, bis mittlere Verdunstung zu verhindern. Follikel-Ovar Co-Kultur. Bereiten Medium für Eierstock-Follikel-Co-Kultur wie für Follikel Kultur in Schritt 2.3.1, aus denen 1 ml Medium für jeden Follikel-Eierstock Co-Kultur aufgebaut. Zur Herstellung von Platten, 1 ml Medium in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen. Mit einer sterilen Uhrmacher Pinzette, legen Sie eine Nucleopore Membran oben auf dem Medium in jedem Well, glänzende Oberfläche auf. UV sterilisieren Membranen vor der Verwendung. 3. Neonatal Ovar Dissection und Kultur Zeigen 1 ml Dissektion Medium in jedem sterilen Glas Embryo Gericht. <li> Cull neonatalen Maus Jungtieren zwischen postnatalen Tag 0 und 5 Jahren, Keulung durch Enthauptung nach britischen Innenministeriums Vorschriften. Fassen Sie die Haut, welche die Bauchwand unter Verwendung eines Paares von feinen Sezierung einer Pinzette und machen einen großen Einschnitt in der Haut und Körperwand. Ziehen Sie die Schnittführung, so dass die gesamte Unterleib ausgesetzt ist. Die Blase ist in der Regel in diesem Stadium angeschwollen und punktiert werden, um Dissektion einfacher. Bewegen Sie den Mut, aus dem Weg mit Uhrmacher Pinzette. Folgen der Uterushörner von der Harnblase bis zu der Niere auf jeder Seite. Der Eierstock ist knapp unterhalb der Niere an der Spitze der Gebärmutter und wird als Cloud-ähnliche Struktur unter einem Binokular angezeigt. Fassen Sie den Eierstock vorsichtig mit Uhrmacher Zangen, und verwenden Sie eine Schere, um ihre Anbringung an der Gebärmutter zu durchtrennen. Übertragen Sie das Paar Eierstöcke in Embryo Schalen mit vorgewärmten Dissektion Medium. Führen Sie die Fein Dissektion der Eierstöcke unter Dissektionsmikroskop auf einem beheizten stage (37 ° C). Verwenden Sie Insulin Nadeln zu schneiden Sie die Bursasack und überschüssiges Material einschließlich der Eileiter, bis nur noch der Eierstock bleibt. Übertragen Sie jede Eierstock in die Vertiefung einer Kulturplatte in Schritt 2.2.2 oben hergestellt, mit einem fein gezeichneten gebogenen Glaspipette, ein Eierstock oben auf jeder Membran (siehe 1A). Kultur in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. Ändern Sie jeden zweiten Tag das Medium. Mit einer Pipette auf 50% des Mediums in jeder Vertiefung für vorge vergast frisches Medium austauschen: Platz am Rand des Brunnens mittel die Pipettenspitze zu vermeiden, die Membran zu stören. Pflegen Kulturen für bis zu 6 Tage. Am Ende der Kultur, Gefriert Medium und zu beheben oder Einfrieren Eierstöcke nach einer kurzen Waschung in PBS, je nach Bedarf. Fix Ovarien in Bouins Fixativ für 90 min für die histologische Analyse, oder in 10% neutral gepuffertem Formalin für 90 min für immunhistologische Analysen. Schnellfrosteierstöcken, indem Gewebe inein Polypropylenrohr, indem das Röhrchen in Trockeneis für 5-10 Minuten vor dem Einfrieren bei -70 ° C für die nachfolgende Protein oder mRNA-Extraktion. 4. Follikel Dissection und Kultur Cull 19-23 Tage alte weibliche Mäuse und zu isolieren, die Eierstöcke. Befeuchten Sie das Fell mit 70% Ethanol, bevor Sie irgendwelche Einschnitte. Halten Sie die Haut mit glatten Enden Zangen und machen einen großen Bauchschnitt mit Dissektion Schere, durchdringt sowohl die Haut und die Körperwand. Bewegen Sie den Darm aus dem Weg mit einem feineren Satz von Dissektionsinstrumente und suchen Sie die Gebärmutter. Folgen der Gebärmutter bis Ovars, der unterhalb der Niere auf jeder Seite befindet. Gently Greifen der Eierstock mit einem Paar Uhrmacher Zangen, trennen Eierstöcke Befestigung an der Gebärmutter mit feinen Sezierung Schere. Vermeiden Sie sammeln zu viel von der Eierstock-Fettpolster. Sammeln Sie die Eierstöcke und die Überführung in ein Embryo Schalen mit vorgewärmten Dissektion Medium. Rebewegen Sie den Eierstock Bursa mit Insulin Nadeln wegschneiden die Bursasack und überschüssiges Material einschließlich der Eileiter, bis nur noch der Eierstock bleibt. Etwa die zu halbieren jedes Ovar mit Insulin Nadeln. Jede Eierstock-Hälfte vorsichtig in ein individuelles Uhrenglas, das 1 ml Dissektion Medium zu übertragen. Cover jede Uhrglas mit einem Glasobjektträger um die Verdampfung des Mediums zu verhindern und Sterilität zu gewährleisten. Shop Uhrengläser mit Ovar Hälften in einem 37 ° C heißen Ofen, bis sie benötigt, aber die Durchführung der nächsten Sektion Schritt so schnell wie möglich. Verwerfen Gewebe auf diese Weise für mehr als eine Stunde gelagert. Über Uhrglas, die einen Eierstock die Hälfte auf eine 37 ° C erhitzt Mikroskoptisch in einer Sterilbank. Rund sezieren Eierstock in große Stücke mit zwei Insulin-Nadeln, um spät vorge Antralfollikeln identifizieren wie folgt: diese werden 2-3 Schichten von Granulosazellen enthalten und einen Durchmesser von etwa 180 bis 200 & mgr; m. Manuelles sezieren jegliche identified Follikel mit einem Insulin Nadel und eine 30 x 0,25 mm Akupunkturnadel, die in einem Nadelhalter befestigt ist. Seien Sie vorsichtig, um die meisten der umliegenden Stroma zu entfernen, aber um eine Beschädigung der Basalmembran der Follikel (siehe Abbildung 1B). Verwenden Sie einen fein gezeichneten gebogenen Glaspipette sorgfältig über seziert Follikel in einen Auffang Uhrglas, die vorgewärmte Dissektion Medium. Achten Sie darauf, Follikel innerhalb der dünnen Kalibers Abschnitt Pipette halten, um nicht zu verlieren Follikel. Messen Follikel genau mit einem kalibrierten Okular-Strichplatte in einem Binokular ausgestattet. Wählen Follikel für die Kultur, wenn sie 190 ± 10 um im Durchmesser messen. Weitere wählen nur gesund, Kugel Follikel für Kultur; diese werden durchlässig sein, ohne dunkle atretischen Bereichen und eine intakte Basalmembran, zusammen mit etwas befestigt thekalen Gewebe: werfen Sie alle Follikel, die nicht passen diese Beschreibung. Es wurde eine Ausbeute von 10-15 Follikel pro Eierstock ist gut. Verwenden Sie einen fein gezeichneten gebogenen Glaspipette, um eine einzelne Follikel in die Vertiefung einer Platte erfunden, wie in Schritt 2.3.3 zu übertragen. Vorsichtig die Follikel im Boden der Vertiefung (und nicht in der oberen Ölschicht). Kultur in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. Kultur Follikel für bis zu 6 Tagen, bewegen Follikel in einen Brunnen mit frischem Medium jeden Tag. Bereiten Sie die nächste Zeile in der 96-Well-Platte wie in Plattenherstellung in Schritt 2.3.3. Rückstellplatte in den Inkubator für mindestens eine Stunde, um ein Gleichgewicht zu ermöglichen. Übertragen Follikel an die frische Brunnen des Mediums, mit einem fein gezeichneten Glaspipette. Wenn zu irgendeinem Zeitpunkt in der Kultur Follikel für zwei Tage, bevor sie in frisches Medium belassen werden, legen jedes Follikel in einem Minimum von 60 & mgr; l (anstatt 30 & mgr; l) Tröpfchen von Follikel Kulturmedium. Um Daten über das Wachstum der Follikel zu sammeln, messen Follikel täglich, mit einem eyepiece Strichplatte in einem Binokular ausgestattet. Die Ölschicht wird Messungen Follikeldurchmesser verzerren, so erarbeiten die Kalibrierungskoeffizienten für das Set-up. Am Ende der Kultur, Einfrieren Medium und fixieren oder Gefriert Gewebe für eine anschließende Analyse, wie in Schritt 3.10 oben. Follikelstimulierendes Follikel Co-Kultur. Kultur zwei Follikel zusammen, um Wechselwirkungen zwischen Follikel zu untersuchen. Kultur wie oben, jedoch legen zwei Follikel Seite-an-Seite, in Kontakt sind, in einem Brunnen. Platzieren 100 ul Tröpfchen Follikel Kulturmedium in jede Vertiefung einer nicht-Gewebekultur behandelten 96-Well-Mikrotiter-Flach-Well-Platte überlagert Medium mit 100 & mgr; l sterilisiertes Silikonöl. Follikel an die frische Brunnen wie in Schritt 4.13 oben übertragen Sie nicht, sondern beauftragen Sie einen feinen Gel-Spitze des Mediums ändern 50% jeden zweiten Tag. Um Gewebe Ursprung innerhalb der Co-Kultur zu identifizieren, Follikel Kokultur jeweils von einem anderen genetischen Quelle, beispielsweise one aus dem Eierstock eines Wildtyp-Maus, und das andere aus dem Eierstock einer Maus mit ubiquitären Expression von GFP. Bei der Verwendung von GFP oder YFP Gewebe minimieren Exposition von Gewebe, um so viel wie möglich Licht, während der Kultur, und durch die Fixierung / Verarbeitungsschritte danach. HINWEIS: Es ist normal, dass sich die beiden Follikel in einem einzigen, "Zwei-Follikel" Einheit wachsen (siehe Abbildung 1C). 5. Follikel-Eierstock-Co-Kulturen Sezieren Eierstöcke und Follikel wie in den Abschnitten 3 und 4 oben. Platzieren einer neonatalen Ovar auf einer Membran, einer Platte, wie in Schritt 2.4.2 oben hergestellt. Vorsichtig einen einzigen Follikel in Kontakt mit einem Pol der neonatalen Eierstock, mit einer fein ausgezogenen gekrümmten Glaspipette. Kultur in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator für bis zu 5 Tage. Um zwischen dem Ursprungsgewebe innerhalb der Co-Kultur zu unterscheiden, verwenden Eierstöcke und Follikel aus zwei verschiedenen sources, beispielsweise eine von einer Wildtyp-Maus und einer von einer Maus mit ubiquitären Expression von GFP. Ersetzen 500 ul Medium täglich, wie in Schritt 3.8 vor, jedoch unter Verwendung von Follikel-Kulturmedium. Während Co-Kultur, die Follikel wird oft vom Ovar (1D) eingekapselt. Am Ende der Kultur, Einfrieren Medium und fixieren oder Gefriert Gewebe für eine anschließende Analyse, wie in Schritt 3.10 oben. 6. Fixierung, Immunzytochemie und Imaging von kultivierten Gewebe Am Ende der Kultur, waschen Gewebe in PBS und Transfer zum 100 ul (Follikel) oder 1 ml (Eierstock) von 10% neutral gepuffertem Formalin, und befestigen Sie 1 Stunde lang auf Eis. Bewegen sich durch 3 Waschungen mit 1x PBS bei 4 ° C. Für Immunzytochemie auf Follikel Übertragung zwischen den Wells einer 96-Well-Mikrotiter-Rund-Well-Platte mit einer fein ausgezogenen gekrümmten Glaspipette, wobei jede Vertiefung mit verschiedenen Waschungen oder Behandlungen. Für Immunzytochemie auf ovaries (oder Eierstock-Follikel-Co-Kulturen), Einbettung in 4% Agarose-Gel und Abschnitt 50 um unter Verwendung einer vibrotome. Schwimmer Abschnitte in die Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen zu Waschungen oder Behandlungen anzuwenden, das Entfernen mit einer Pipette. Für die Bildgebung: übertragen Agarose Abschnitte Flachglasobjektträger und montieren mit Montageträger; oder Übertragung Follikel (oder Follikel Follikel-Komplexe), um den Hohlraum Glasobjektträger und montieren mit nicht-härtendes Eindeckmittel. Bild Proben mit einem konfokalen Mikroskop.