Summary

Синтез индоксил-гликозидов для обнаружения гликозидазой деятельности

Published: May 27, 2015
doi:

Summary

Indoxyl glycosides are well-established and widely used tools for enzyme screening and enzyme activity monitoring. Especially for glucose type structures previous syntheses proved to be challenging and low yielding. Our novel approach employs indoxylic acid esters as precious intermediates to yield a considerable number of indoxyl glycosides in good yields.

Abstract

Indoxyl glycosides proved to be valuable and versatile tools for monitoring glycosidase activities. Indoxyls are released by enzymatic hydrolysis and are rapidly oxidized, for example by atmospheric oxygen, to indigo type dyes. This reaction enables fast and easy screening in vivo without isolation or purification of enzymes, as well as rapid tests on agar plates or in solution (e.g., blue-white screening, micro-wells) and is used in biochemistry, histochemistry, bacteriology and molecular biology. Unfortunately the synthesis of such substrates proved to be difficult, due to various side reactions and the low reactivity of the indoxyl hydroxyl function. Especially for glucose type structures low yields were observed. Our novel approach employs indoxylic acid ester as key intermediates. Indoxylic acid esters with varied substitution patterns were prepared on scalable pathways. Phase transfer glycosylations with those acceptors and peracetylated glycosyl halides can be performed under common conditions in high yields. Ester cleavage and subsequent mild silver mediated glycosylation yields the peracetylated indoxyl glycosides in high yields. Finally deprotection is performed according to Zemplén.

Introduction

В течение долгого времени производство индиго был экономически очень важный процесс. Перед крупномасштабных химических синтезов дал дешевый доступ к индиго, предшественники были получены из природных источников с дохристианских времен. Выращивание индиго обеспечения растений (естественно индиго) в Европе стал неблагодарным в 17-м веке, как количество индиго предшественники индийской индиго (0,2-0,8%) составляет около 30 раз выше. В конце 19-го века химического синтеза индиго подавил обычный выращивание 1,2.

Indigo предшественники, происходящие в растениях включают индикана (1), Insatan A (2) и Isatan B (3) (рис 1). Все они состоят из индоксил мотива, связанного с гликозильного остатка. Расщепление гликозидной связи, например, с помощью ферментативного гидролиза, приводит к выделению индоксил (4). Сама индоксил практически бесцветны, но могут быть быстро окисляется с образованием индиго Краситель (5). Это чувствительная реакция была адаптирована в биохимии, бактериологии, гистохимии и молекулярной биологии для мониторинга активности ферментов. Скрининг активности в естественных условиях без выделения или очистки ферментов, а также экспресс-тесты на чашках с агаром или в растворе (например, бело-голубым скрининга, микро-скважин) возможно. В зависимости от остатка (например, сложные эфиры, гликозиды, сульфаты), связанного с индоксил фрагмента, пригодными субстратами в различных классов ферментов (например, эстераз, глюкозидазы, сульфатазы) были разработаны 3. В следующем внимание будет уделено формированию и применению индоксил гликозидов.

Фигура 1
Рисунок 1: Природные предшественники индиго и формирование красителя индиго путем гидролиза.цель = "_ пустое"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Замещение картина индоксил фрагмента определяет цвет и физические свойства полученного красителя индиго. Наиболее распространенные шаблоны замещения 5-бром-4-хлор (сокращенно от X; зеленовато-голубой), 5-бром (синий) и 5-бром-6-хлор (пурпурный), так как они образуют мельчайшие частицы красителя, делают не образуют гранулы и имеют наименьший диффузию из участков гидролиза. Последнее свойство особенно важно для естественных условиях экспериментов в 3.

Первый доклад о indigogenic метода для обнаружения эстеразы был опубликован в 1951 году и Barrnett Селигман, который занятого индоксил ацетат и бутират 4. О десятилетие спустя indigogenic принцип был адаптирован для локализации глюкозидазы млекопитающих 5. До сих пор несколько индоксил гликозидов были разработаны, хотя их синтез оказался трудно. Большинство синтезов на основе использования в -acetylated индоксил N в качестве акцептора и соответствующих гликозилгалогенидом донора 6-14. Гликозилирование проводят в ацетоне с помощью гидроксида натрия. В этих условиях количество побочных реакций происходит, значительно уменьшая выход. Специально для глюкозы структур типа очень низкие выходы гликозилирования сообщалось (например, 15% (N-ацетил-5-бром-4-хлор-индол-3-ил) -2,3,4,6-тетра-О-ацетил -β-ᴅ-глюкопиранозид 6 и 26% (N-ацетил-5-бром-4-хлор-индол-3-ил) -2,3,2 ', 3', 4'-пента вывода -acetyl- β-ᴅ-xylobioside 14 в более недавний пример). Через новый подход, используя сложные эфиры indoxylic кислоты, значительное количество индоксил гликозидов были получены с хорошим выходом (например, (N-ацетил-5-бром-4-хлор-индол-3-ил) -2,3,4, 6-тетра-О-ацетил-β-ᴅ-глюкопиранозид выход 57%).

_content "> Следующий протокол описывает простой синтез indoxylic кислоты аллилового эфира (5-бром-4-хлор) и на их основе синтеза с индоксил гликозида (X-Gal). Простой модельный эксперимент показывает ферментную реактивность β- галактозидазы с использованием X-Gal.

Protocol

General remarks: All reactions were carried out using a fume hood and appropriate personal protective equipment. All reagents and solvents (p.a.; water content for dry solvents: MeCN <50 ppm; Et2O <0.01%; CH2Cl2 <0.003%; THF <0.005%) were purchased from commercial sources and used as received. TLC was performed on Merck silica gel 60 F254 plates. Compounds were detected by UV and/or by treatment with EtOH/H2SO4 (9:1…

Representative Results

The very first syntheses of indicane and 5-bromo-indicane, were published by Robertson already in 1927 and 192915,16. By employing indoxylic acid methyl ester as acceptor, the reactive 2-position was blocked and thus side reactions were partially suppressed. Glycosylation in acetone/sodium hydroxide, following deprotection and decarboxylation (160 °C, acetic anhydride, 1 hr) and finally deacetylation yielded Indicane and 5-bromo-indicane. Based on this concept we developed an improved synthesis of indoxyl…

Discussion

Owing to poor yields and limitations, especially for glucose type structures and more complex saccharides, a novel synthetic approach towards indoxyl glycosides was developed. Indoxylic acid esters proved to be precious key intermediates and were obtained in a modular, scalable pathway. All steps are high yielding and due to cheap starting materials and easy workup multi-gram syntheses are possible. The advantage of the allyl ester approach is the blocking of the reactive 2-position. Thus yield decreasing side reactions …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Support of this work by Glycom A/S, Copenhagen, Denmark, is gratefully acknowledged.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Acetic anhydride Grüssing 10298 Corrosive, flammable
Acetonitrile Sigma-Aldrich 608-001-00-3 Harmful, flammable
Allyl alcohol Aldrich 453021 Harmful, dangerous for the environment
Amberlite IR-120 H+ Fluka 06428 Irritant
Bromoacetic acid Merck 802260 Corrosive, toxic, dangerous for the environment
4-Bromo-3-chloro-2-methylaniline ABCR AB 171687 Irritant
Dichloromethane ACROS 326850010 Harmful
Diethyl ether Grüssing 10274 Harmful, extremly flammable
Dimethylformamide ACROS 348430010 Harmful, flammable
Dimethylsulfoxide Sigma-Aldrich 41648
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 607-022-00-5 Irritant, flammable
Ethylenediaminetetraacetic acid AppliChem A1103.0500 Irritant
ß1,3-Galactosidase, Recombinant, E. coli Calbiochem 345795
Hydrochloric acid VWR  20252.290 Corrosive
Magnesium sulfate hydrate Merck 105885
Methanol ACROS 326950010 Toxic, flammable
Morpholine Janssen Chimica 15.868.57 Corrosive, flammable
Peroleum ether Azelis 111053 Flammable, irritant, dangerous for the environment
Potassium carbonate Grüssing 12005 Corrosive
Potassium permanganate Grüssing 12056 Harmful, oxidising
Potassium tert-butoxide Merck 804918 Corrosive, flammable
Pyridine Sigma-Aldrich 613-002-00-7 Harmful, flammable
Silver acetate Fluka 85140 Irritant, dangerous for the environment
Sodium bicarbonate Grüssing 12144 Corrosive
Sodium hydride Merck 814552 Corrosive, flammable
Sodium hydroxide Riedel-de Häen S181200 Corrosive
Sodium methanolate Merck 806538 Corrosive, flammable
Sodium sulfate Grüssing 12175
Tetrabutylammonium hydrogensulfate Lancaster 5438 Harmful
Tetrahydrofurane Sigma-Aldrich 87371 Harmful, flammable
Tetrakis(triphenylphosphine)palladium(0) Sigma-Aldrich 216666
Triphosgene Fluka 15217 Toxic
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride  Sigma T-3253 Irritant

Referencias

  1. Clark, R. J. H., Cooksey, C. J., Daniels, M. A. M., Withnall, R. Indigo, Woad, and Tyrian Purple: Important Vat Dyes from Antique to the Present. Endeavour. 17, 191-199 (1993).
  2. Hunger, K. . Industrial Dyes: Chemistry, Properties, Applications. , (2003).
  3. Kiernan, J. A. Indigogenic Substrates for Detection and Localization of Enzymes. Biotechn. Histochem. 82, 73-103 (2007).
  4. Barnett, R. J., Seligman, A. M. Histochemical Demonstration of Esterases by Production of Indigo. Science. 114, 579-582 (1951).
  5. Pearson, B., Andrews, M., Grose, F. Histochemical Demonstration of Mammalian Glucosidase by Means of 3-(5-Bromoindolyl)-β-ᴅ-glucopyranoside. Exp. Biol. Med. 108, 619-623 (1961).
  6. Anderson, F. B., Leaback, D. H. Substrates for the Histochemical Localization of some Glycosidases. Tetrahedron. 12, 236-239 (1961).
  7. Van Dort, M. E., Lee, K. C., Hamilton, C. A., Rehemtulla, A., Ross, B. R. Radiosynthesis and Evaluation of 5-[125I]Iodoindolyl-3-yl-β-ᴅ-galactopyranoside ([125I]IBDG) as a β-Galactosidase Imaging Radioligand. Mol. Imaging. 7, 187-197 (2008).
  8. Yoshida, K., Iino, N., Koga, I. Syntheses of Halogen Substituted β-ᴅ-Glucuronides and Their Hydrolysis by Rabbit Liver β-Glucoronidase. Chem. Pharm. Bull. 32, 1759-1769 (1975).
  9. Horwitz, J. P., et al. Substrates for Cytochemical Demonstartion of Enzyme Activity I. Some Substituted 3-Indolyl-β-ᴅ-glycopyranosides. J. Med. Chem. 7, 574-575 (1964).
  10. Eschenfelder, V., Brossmer, R. 5-Bromo-indol-3-yl 5-Acetamido-3,5-dideoxy-α-ᴅ-glycero-ᴅ-galactononulopyranosidic Acid, a Novel Chromogenic Substrate for the Staining of Sialidase Activity. Glycoconjugate J. 4, 171-178 (1987).
  11. Fujii, I., Iwabuchi, Y., Teshima, T., Shiba, T., Kikuchi, M. X-Neu5Ac: A Novel Substrate for Chromogenic Assay of Neuraminidase Activity in Bacterial Expression Systems. Bioorg. Med. Chem. 1, 147-149 (1993).
  12. Berlin, W., Sauer, B. In situ Color Detection of α-ʟ-Arabinofuranisodase, a "No-Background" Reporter Gene, with 5-Bromo-3-indolyl-α-ʟ-arabinofuranoside. Anal. Biochem. 243, 171-175 (1996).
  13. Marmuse, L., et al. New Chromogenic Substrates for Feruloyl Esterases. Org. Biomol. Chem. 6, 1208-1214 (2008).
  14. Kaneko, S., Kiaoka, M., Kuno, A., Hayashi, K. Syntheses of 4-Methylumbelliferyl-β-ᴅ-Xylobioside and 5-Bromo-3-Indolyl-β-ᴅ-Xylobioside for Sensitive Detection of Xylanase Activity on Agar Plates. Biosci. Biotechnol. Biochem. 64, 741-745 (2000).
  15. Robertson, A. J. Syntheses of Glucosides. Part I. The Synthesis of Indican. Chem. Soc. , 1937-1943 (1927).
  16. Robertson, A., Waters, R. B. J. Synthese of Glucosides. Part VII. The Synthesis of 6-Bromoindican. Chem. Soc. , 2239-2243 (1929).
  17. Böttcher, S., Thiem, J. Indoxylic Acid Esters as Convenient Intermediates Towards Indoxyl Glycosides. Eur. J. Org. Chem. , 564-574 (2014).
  18. Böttcher, S., Hederos, M., Champion, E., Dékány, G., Thiem, J. Novel Efficient Routes to Indoxyl Glycosides for Monitoring Glycosidase Activities. Org. Lett. 15, 3766-3769 (2013).
  19. Böttcher, S., Thiem, J. Facile Preparation of Indoxyl- and Nitrophenyl Glycosides of Lactosamine and Isolactosamine. RSC Adv. 4, 10856-10861 (2014).

Play Video

Citar este artículo
Böttcher, S., Thiem, J. Synthesis of Indoxyl-glycosides for Detection of Glycosidase Activities. J. Vis. Exp. (99), e52442, doi:10.3791/52442 (2015).

View Video