Influenza Virus Propagazione in embrionate di pollo Uova
Summary
Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.
Abstract
Infezione influenzale è associata con circa 36.000 morti e più di 200.000 ricoveri ogni anno negli Stati Uniti. L'emergere continuo di nuovi ceppi di virus influenzale dovute alla mutazione e ri-assortimento complica il controllo del virus e richiede lo sviluppo permanente di nuovi farmaci e vaccini. Lo studio in laboratorio di influenza richiede un metodo affidabile e conveniente per la propagazione del virus. Qui, un protocollo globale è costituita per influenza A propagazione dei virus in uova di gallina fertili, che produce costantemente le scorte virali ad alto titolo. In breve, esenti da organismi patogeni (SPF) uova di gallina fecondate siero sono incubate a 37 ° C e 55-60% di umidità per 10 – 11 giorni. In questo periodo, lo sviluppo dell'embrione può essere facilmente monitorato mediante un Candler uovo. Virus inoculazione viene effettuata mediante iniezione del virus magazzino nella cavità allantoidea utilizzando un ago. Dopo 2 giorni di incubazione a 37 ° C, le uova sonorefrigerata per almeno 4 ore a 4 ° C. Il guscio d'uovo sopra la sacca d'aria e la membrana corioallantoidea sono poi accuratamente aperto, e il liquido allantoico contenente il virus è raccolto. Il fluido viene cancellato da detriti mediante centrifugazione, aliquotato e trasferito a -80 ° C per la conservazione a lungo termine. La grande quantità (5-10 ml di virus contenenti liquido per uovo) titolo e precisa di virus che di solito si ottiene con questo protocollo ha reso l'utilizzo di uova per la preparazione virus nostro metodo favorevole, in particolare per gli studi in vitro, che richiedono grandi quantità del virus in cui sono necessari dosaggi elevati di virus stesso magazzino.
Introduction
Influenza A continua ad essere una grave minaccia per la salute umana. Si tratta di una malattia respiratoria potenzialmente devastante con un grande carico globale provocando fino a 500.000 morti nel mondo ogni anno 1. I virus influenzali sono nella famiglia Orthomyxoviridae e portano a 8 negativo-sense singolo filamento di RNA nel loro genoma 1,2. L'elevata mutevolezza (cioè, "drift" antigenico) del genoma virale impedisce immunità a lungo termine. Inoltre, l'influenza è sempre più resistenti ai farmaci anti-virali 3.
Il 2009 H1N1 pandemia influenzale ha evidenziato tutti i problemi difficili associati alla malattia influenzale (ceppo pandemico, la resistenza anti-virale, la produzione di vaccini in ritardo). La formulazione del vaccino è determinato annualmente dalla Organizzazione Mondiale della Sanità per i ceppi influenzali più probabile patogeni (uno ciascuno per H1N1, H3N2 e influenza B) 4. Poiché questo metodo si basa su ceppo influenzale previstos, i ceppi patogeni sono a volte erroneamente identificati e l'efficacia del vaccino si riduce drasticamente. Inoltre, la comparsa di nuovi ceppi di influenza può aggirare questi programmi di prevenzione che causano pandemie 2.
La creazione di un vaccino influenzale universale è stato sfuggente 5. Pertanto, la ricerca deve continuare nella comprensione della patogenesi del danno polmonare. Per struttura di ricerca di laboratorio, diversi metodi sono stati sviluppati per l'isolamento virale e la propagazione 6. Virus influenzali umani possono essere amplificati in una varietà di substrati cellulari di mammifero. Tuttavia, generando virus ad alto titolo in grandi quantità sono più raggiunti in uova embrionate. Il protocollo che segue descrive una tecnica per l'influenza A la propagazione del virus e lo stoccaggio delle scorte di virus esistenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Influenza provoca un grande carico globale di malattia, e il lavoro continua nella comprensione della patogenesi del danno polmonare 7. Per la ricerca facilitato in questa malattia mortale, vari metodi sono stati sviluppati per diffondere il virus dell'influenza 6. Qui, descriviamo una tecnica per la produzione di virus dell'influenza in uova di gallina. Il vantaggio di questo metodo è che è altamente riproducibile e si traduce in grandi quantità ad alto titolo di riserve di virus influe…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present study was supported by the NIH grants HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.), and the American Heart Association Grant-in-Aid (P.C.)
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs | VALO BioMedia | n/a | |
| humidified egg incubator | FARM iNNOVATORS | Model 2100 | |
| automatic egg turner | FARM iNNOVATORS | Model 3200 | |
| egg candler | FARM iNNOVATORS | Model 3300 | |
| 1 ml syringe | BD Bioscience | 309659 | |
| 18G needle | BD Bioscience | 305196 | |
| 20G / 22G needle | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ethanol, >99.5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluted to 70% using water |
| glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | Model 1105 | |
| glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| MDCK cells | ATCC | CRL-2935 | |
| Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
Referencias
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