鶏卵卵におけるインフルエンザウイルスの伝播
Summary
Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.
Abstract
インフルエンザ感染は約36000人が死亡、米国では20万人以上の入院毎年と関連している。突然変異再類別による新しいインフルエンザウイルス株の連続的な出現は、ウイルスの制御を複雑にし、新規薬剤およびワクチンの永久的な開発を必要とする。インフルエンザの実験室ベースの研究では、ウイルスの増殖のための信頼性とコスト効果的な方法が必要です。ここで、総合的なプロトコルは、一貫して高い力価のウイルスストックをもたらす肥沃鶏卵におけるインフルエンザAウイルスの増殖のために提供される。 11日目 – 要するに、血清病原体フリー（SPF）ニワトリ受精卵を37℃、10 55〜60％の湿度でインキュベートする。この期間、胚発生を容易に卵キャンドラーを用いてモニターすることができる。ウイルス接種針を用いて、尿膜腔へのウイルスストックを注入することにより行われる。 37℃でのインキュベーションの2日後、卵は4℃で少なくとも4時間冷却した。気嚢と漿尿膜上卵殻を注意深く開かれ、ウイルスを含む尿膜液を採取する。流体は、遠心分離によってデブリからクリア等分し、長期保存のために-80°Cに転送される。大量（卵あたりウイルス液5-10）に溶解し、通常、このプロトコルを用いて達成される、高ウイルス力価は、ウイルス調製物のために大量に必要とするin vitro試験のために、特に我々の有利な方法は、卵の使用を行っているウイルスの同じウイルスストックの高用量が必要とされている。
Introduction
インフルエンザAは、ヒトの健康に対する大きな脅威であり続けている。これは、大規模なグローバルな負担が世界中で毎年150万の死亡までの原因と潜在的に壊滅的な呼吸器疾患である。インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科にあり、それらのゲノム1,2- 8ネガティブセンス一本鎖RNAを運ぶ。ウイルスゲノムの高い可変性（ すなわち 、抗原性「ドリフト」）は、長期的な免疫を防ぐことができます。また、インフルエンザは、抗ウイルス薬3にますます抵抗性がある。
2009年新型インフルエンザのパンデミックは、インフルエンザ疾患（パンデミック株、抗ウイルス耐性、遅延ワクチン製造）に関連するすべての困難な問題を強調した。ワクチン製剤は最も可能性の高い病原性インフルエンザ株4（H1N1、H3N2およびB型インフルエンザ用に1つずつ）のために世界保健機関が毎年決定 されます。この方法は、予測されたインフルエンザ株に基づいているのでsは、病原性株は時折間違って識別され、ワクチンの有効性は劇的に低下する。また、新型インフルエンザ株の出現はパンデミック病気2を引き起こすこれらの予防プログラムを回避することができます。
ユニバーサルインフルエンザワクチンの作成 は5とらえどころのないされている。そのため、研究は肺損傷の病因の理解に続けなければならない。施設研究室の研究のために、いくつかの方法は、ウイルスの単離および増殖6のために開発されている。ヒトインフルエンザウイルスは、哺乳動物細胞、種々の基材に増幅することができる。しかし、大量に発生する高力価のウイルスは、最高の孵化卵内で達成される。以下のプロトコルは、インフルエンザのために既存のウイルスストックからのウイルスの伝播とストレージを技術が記載されている。
Protocol
Representative Results
Discussion
インフルエンザは、疾患の大規模なグローバル負担が発生し、作業が肺損傷7の病因を理解することに継続する。この致命的な疾患で容易に研究し、種々の方法は、インフルエンザウイルス6を伝播するために開発されている。ここでは、鶏卵中でインフルエンザウイルスを製造する技術が記載されている。この方法の利点は、それが高度に再現可能であることであり、多くの<…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present study was supported by the NIH grants HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.), and the American Heart Association Grant-in-Aid (P.C.)
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs | VALO BioMedia | n/a | |
| humidified egg incubator | FARM iNNOVATORS | Model 2100 | |
| automatic egg turner | FARM iNNOVATORS | Model 3200 | |
| egg candler | FARM iNNOVATORS | Model 3300 | |
| 1 ml syringe | BD Bioscience | 309659 | |
| 18G needle | BD Bioscience | 305196 | |
| 20G / 22G needle | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ethanol, >99.5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluted to 70% using water |
| glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | Model 1105 | |
| glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| MDCK cells | ATCC | CRL-2935 | |
| Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
Referencias
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Estimates of deaths associated with seasonal influenza — United States, 1976-2007. MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
- Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).
- Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
- Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. Influenza and the challenge for immunology. Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).
- Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323 (1), 115-139 (2014).
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. . Current protocols in microbiology. , (2006).
- Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome. Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).
- Ito, T., Suzuki, Y., et al. Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection. J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).
- Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses. J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells). Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).
