JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Traducción Automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Quimica

Kimyasal Fiksasyon X-ışını Floresans Görüntüleme Değme Hücreleri hazırlanması

Published: March 12, 2015
doi:
10.3791/52370
,
1X-ray Science Division, Advanced Photon Source,Argonne National Laboratory, 2Department of Physics and Astronomy,Northwestern University

Summary

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Abstract

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Introduction

Floresan Görüntüleme kimlik ve bir numunede bulunan elementlerin nicelik sağlar X-ışını uzaysal çözülmesi. Olay X-ışınları, ilgi konusu ağır elemanının bağlanma enerjisi elektron daha büyük olacak şekilde seçilir, bir enerji, hücre çekirdeğinin 1 iç kabuk elektronların bağlanma enerjisi üstesinden gelir. Bu elektron kabuğu bir 'delik' oluşturur. Yüksek enerjili elektronlar bu deliklerin içine düşmek gibi, floresan X-ışınları dalga boyu bu orbitallerinin enerji ayrımı bağlıdır yayılır. Orbital enerji aralığı, belirli bir elemanın karakteristik olduğu için, X-ışını floresans emisyon da aletin göre karakteristik dalga boylarında, yer alır. Mevcut elemanların belirlenmesini sağlar karakteristik dalga boyunda bu emisyon olduğunu. Floresan yoğunluğunun kalibrasyonu bulunan elementlerin kantitatif sağlar.

X-ışını flüoresans mikroskopy (XFM) kısmen böyle Bahar-8 Japonya'da, Avrupa Radyasyon Sinkrotron Tesisi Fransa'da (SDBY), ve İleri Foton Kaynağı (olanların çok parlak X-ışını sinkrotron kaynaklarının gelişimine, giderek kullanılan haline gelmiştir ABD'de 2 APS). Bu kaynaklar çok yüksek yoğunluklu X-ışını kirişler sağlamak. Aynı zamanda, böyle bir bölge plaka teknolojisi gibi X-ışını optik gelişmeler, oldukça verimsiz 3 olsa, alt-mikron noktalar bu kirişlerin odaklanarak izin. Çok yüksek yoğunluklu kirişler, mevcut detektör teknoloji ile ölçülebilir hücrelerde endojen metallerin uyarmak için yeterlidir odaklanabilir ışık bile nispeten küçük bir miktarı, üretim sinyali ile. Böylece, hücrenin içindeki metallerin kimyasal biyoloji okuyan bu teknikle 4-10 son gelişmelerin birçoğu kullanan özellikle bir uygulamadır.

App sırasında dikkate alınması gereken birçok kritik faktör vardırXFM yatan kültürlenmiş memeli hücreleri veya diğer biyolojik örneklerin temel dağılımı ve miktarının araştırılması. İlk olarak, numune anlamlı olması için ölçme amacıyla, hem yapısal ve elementel kompozisyon bakımından, sağlam tutulması gerekir. Bu odaklanmış bir X-ışını neden olabilir, radyasyona karşı dayanıklı olacak şekilde İkinci olarak, örnek de bir şekilde korunmalıdır. Bir örnek bir seferde bu iki ölçütü karşılayan bir yolu, hızlı bir şekilde camsı, amorf buz 11,12 içine dondurulacaksa. Hızlı dondurma genellikle dalma dondurma ya da yüksek basınçlı 13-16 dondurma gibi çeşitli dondurarak saklama teknikleri ile elde edilir. Genellikle, dondurarak saklama mümkün yerli halde yakın olarak biyolojik numunelerde toplam hücresel bir yapıya ve kimyasal bileşimleri muhafaza ettiği kabul edilmektedir. Hücrelere ve dokulara fiksatif yavaş ve seçici penetrasyon nedeniyle diğer taraftan Kimyasal sabitleme, well membran geçirgenliği olarak sonradan yapılacak değişiklikler, çeşitli hücresel iyonları özellikle Cl, Ca ve K gibi yayılabilir iyonlar böylece 17-19 suboptimaldir bu unsurların soruşturma render, süzülür kayıp ya da taşındı izin verebilir. Özellikle yapışık memeli hücrelerinde genel olarak kimyasal sabitleme, üzerinde cryo-tespitin net avantajına rağmen, Kriyoprezervasyonun çeşitli sınırlamalar 20-23 sahiptir. En belirgin değil, her araştırma laboratuvarı dondurarak saklama araçlarına kolay erişim olmasıdır. Hatta En güncel yüksek basınç dondurucular veya dondurucular sadece kadar hücreler kuluçkaya yerden olabilir cryo tesisleri bir alt tarafından pahalı ve sahip olduğu vardır dalma. kryoprezervasyon yararı hücreleri üzerinde yerleştirilen seyahat stres dezavantajı işlem olabilir. Dondurulması kesinlikle X-ışını floresans analizi için numune korumak için en titiz şekilde Böylece, bu kesinlikle her koşulda tüm araştırmacılara en erişilebilir değil;ne de her zaman önemlidir – ilgi metaller sıkı düzeltilebilir makromoleküllerin bağlı ve numune yansıması olacak hangi çözünürlük kurutma sırasında meydana gelebilecek ultra mikro hasar büyükse eğer. Uyarılar 24 Dikkatli, kimyasal tespiti ve kurutma uygun bir seçim olabilir.

Başarılı bir X-ışını fluoresans görüntüsü elde deneyde diğer faktörler uygun analiz içerir. X-ışını floresans görüntüleme temelde uzaysal çözünürlüğü sağlamak için raster tarama ile birlikte X-ışını floresans emisyon spektroskopisi olduğunu. Toplanan X-ışını floresans emisyon spektrumları emisyon zirveleri, arka plan, ve olay kirişin elastik ve inelastik saçılma doruklarına örtüşen bir kombinasyonunu içerir. Bu katkıların de-büklüm, ve emisyon doruklarına montajını sağlayan yazılım, bu alanda 25 kritik gelişme olmuştur. Ayrıca, geliştirme ve ticari distMalzeme miktar floresan yoğunluğu göreceli kalibre etmek için kullanılır bilinen kompozisyon, ince film standartlarının ribution, aynı zamanda çok önemli olmuştur.

Bu protokol, kimyasal sabitleme ve hava kurutma ile yapışan hücrelerin hazırlanması için bir tanımını sağlar. Bu süreçte hayati bir adım genellikle başarı için belirli bir moda anahtarı nazik durulama yaparak, iyi uymayan silisyum nitrür windows hücrelerin büyüme.

Protocol

Göstergeler, Materyalden, Kültür Medya ve Yemekleri 1. Hazırlık Silikon nitrür (Si 3 N 4) pencere Taşıma. Öte yandan, kapsül diğer ucunu dönerken, hafif, pencerenin kendisinin sıkmak üzere olan bir şekilde bir pencere ihtiva eden bir ucu sıkarak kapsül açın. Ters bir çift kontrol, stereomicroscope altında ince uçlu cımbız ucunda hiçbir yapıştırıcı, boşluklar veya virajlı olmadığından emin olmak için. Aksi takdirde, pencere cımbız i…

Representative Results

Biyolojik örnekler hakkında bilgi temin etmek üzere X-ışını floresans görüntüleme yeteneği, bu örnekler, deney süresi ölçeğinde radyasyona karşı sağlam bir şekilde hazırlanmaktadır edilmesine bağlıdır ve yine kimyasal ve yapısal özellikleri iyi olan korunmuş. Tespit hücrenin bu yönleri, (Şekil 1) korunmuş olduğunu gösteren – yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanmış ve görüntülenmiştir olan bir numune sonucu görüntüleme olarak, bu elemanlar varyasyon olduğun…

Discussion

X-ışını floresans görüntüleme yerbilimleri, malzeme bilimi ve kimya biyoloji 26-34 olmak üzere birçok alanda, yararlıdır. Sinkrotron X-ışınları gelişmeler ve onların odaklanarak, çok yüksek yoğunluklu ışınları üretmişlerdir. Odaklı X-ışını mevcut silikon sürüklenme detektörü teknolojisi ile ölçülebilir sinyalinin oluşturulması, şu anda varolan hücreler endojen metallerin uyarmak için yeterli kirişler. Ve hücrede metallerin kimyasal biyoloji okuyan bu alandaki son g…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors acknowledge Stefan Vogt for his assistance in the fitting of the representative data shown in this paper, and helpful discussions. The authors also acknowledge Chris Jacobsen for his support to Q. J.

Use of the Advanced Photon Source, beamlines 2-ID-E and 8-BM-B, at Argonne National Laboratory was supported by the U. S. Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, under Contract No. DE-AC02-06CH11357.

Materials

silicon nitride windows Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom No part numbers available. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm.  Thickness 500 nm.  Frame size: 5 mm x 5 mm.  Frame thickness: 200 µm Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc.West Chester, PA
reverse tweezers Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 78520-5X EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers
rubber grid mat Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 71170 Round Grid Mat
acetic acid Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 338826 trace metals grade concentrated acetic acid
PIPES buffer Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052 P6757 solid PIPES buffer
formaldehyde stock solution Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450 RT 17113 10 x 10mL ampules of 20% aqueous paraformaldehyde
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Thompson, A. C. . Center for X-ray Optics and Advanced Light Source. , 1-53 (2009).
  2. Helliwell, J. R. Synchrotron radiation facilities. Nat. Struct. Biol. 5, 614-617 (1988).
  3. Lai, B., et al. X-ray Phase Zone Plate Fabricated by Lithographic Techniques. Appl. Phys. Lett. 61 (16), 1877-1879 (1992).
  4. Dodani, S. C., et al. Calcium-dependent copper redistributions in neuronal cells revealed by a fluorescent copper sensor and X-ray fluorescence microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 5980-5985 (2011).
  5. Finney, L., et al. X-ray fluorescence microscopy reveals large-scale relocalization and extracellular translocation of cellular copper during angiogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (7), 2247-2252 (2007).
  6. Kehr, S., et al. X-ray fluorescence microscopy reveals the role of selenium in spermatogenesis. J. Mol. Biol. 389 (5), 808-818 (2009).
  7. McCormick, N., Velasquez, V., Finney, L., Vogt, S., Kelleher, S. L. X-ray fluorescence microscopy reveals accumulation and secretion of discrete intracellular zinc pools in the lactating mouse mammary gland. PloS One. 5 (6), (2010).
  8. Paunesku, T., Vogt, S., Maser, J., Lai, B., Woloschak, G. X-ray fluorescence microprobe imaging in biology and medicine. J. Cell. Biochem. 99 (6), 1489-1502 (2006).
  9. Twining, B. S., et al. Quantifying trace elements in individual aquatic protist cells with a synchrotron X-ray fluorescence microprobe. Anal. Chem. 75 (15), 3806-3816 (2003).
  10. Chen, S., et al. The Bionanoprobe: hard X-ray fluorescence nanoprobe with cryogenic capabilities. J Synchrotron Radiat. 21, 66-75 (2014).
  11. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
  12. Forster, F., Medalia, O., Zauberman, N., Baumeister, W., Fass, D. Retrovirus envelope protein complex structure in situ studied by cryo-electron tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (13), 4729-4734 (2005).
  13. Muller, M., Moor, H. . Science of Biological Specimen. , 131-138 (1984).
  14. Moor, H., Riehle, U. . Proceedings of the 4th Eur. Reg. Conference Electron. , 33-34 (1968).
  15. Sitte, H. Advanced instrumentation and methodology related to cryoultramicrotomy: a review. Scanning Microsc Suppl. 10, 387-463 (1996).
  16. Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J. Microsc. 203, (Pt. 3, 285-294 (2001).
  17. Matsuyama, S., et al. Elemental mapping of frozen-hydrated cells with cryo-scanning x-ray fluorescence microscopy). X-Ray Spectrom. 39, 260-266 (2010).
  18. Schrag, M., et al. The effect of formalin fixation on the levels of brain transition metals in archived samples. Biometals. 23 (6), 1123-1127 (2010).
  19. James, S. A., et al. Quantitative comparison of preparation methodologies for X-ray fluorescence microscopy of brain tissue. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (3), 853-864 (2011).
  20. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23 (18), 3583-3588 (2004).
  21. Bouchet-Marquis, C., Hoenger, A. Cryo-electron tomography on vitrified sections: a critical analysis of benefits and limitations for structural cell biology. Micron. 42 (2), 152-162 (2011).
  22. Bouchet-Marquis, C., Dubochet, J., Fakan, S. Cryoelectron microscopy of vitrified sections: a new challenge for the analysis of functional nuclear architecture. Histochem. Cell Biol. 125 (1-2), 1-2 (2006).
  23. Mesman, R. J. A novel method for high-pressure freezing of adherent cells for frozen hydrated sectioning and CEMOVIS. J. Struct. Biol. 183 (3), 527-530 (2013).
  24. Hackett, M. J., et al. Chemical Alterations to murine brain tissue induced by formalin fixation: implications for biospectroscopic imaging and mapping studies of disease pathogenesis. Analyst. 136 (14), 2941-2952 (2011).
  25. Vogt, S. MAPS: A set of software tools for analysis and visualization of 3D x-ray fluorescence data sets. J Phys IV France. 104, 635-638 (2003).
  26. Vantelon, D., Lanzirotti, A., Scheinost, A. C., Kretzschmar, R. Spatial distribution and speciation of lead around corroding bullets in a shooting range soil studied by micro-X-ray fluorescence and absorption spectroscopy. Environ. Sci. Technol. 39 (13), 4808-4815 (2005).
  27. Robison, G., et al. X-ray fluorescence imaging of the hippocampal formation after manganese exposure. Metallomics : Integrated Biometal Science. 5 (11), 1554-1565 (2013).
  28. Hard Kemner, K. M. X-ray micro(spectro)scopy: a powerful tool for the geomicrobiologists. Geobiology. 6 (3), 270-277 (2008).
  29. Walsh, W. Scientific Testing of Beethoven’s Hair. 17, (2000).
  30. Casadio, F., Rose, V. High-resolution fluorescence mapping of impurities in historical zinc oxide pigments: hard X-ray nanoprobe applications to the paints of Pablo Picasso. Applied Physics A: Materials Science and Processing. 111 (1), 1-8 (2013).
  31. Leonardo, T., et al. Determination of elemental distribution in green micro-algae using synchrotron radiation nano X-ray fluorescence (SR-nXRF) and electron microscopy techniques–subcellular localization and quantitative imaging of silver and cobalt uptake by Coccomyxa actinabiotis. Metallomics : Integrated Biometal Science. 6 (2), 316-329 (2014).
  32. Wang, P., et al. Quantitative determination of metal and metalloid spatial distribution in hydrated and fresh roots of cowpea using synchrotron-based X-ray fluorescence microscopy. Sci. Total Environ. , 463-464 (2013).
  33. Ducic, T., et al. X-ray fluorescence analysis of iron and manganese distribution in primary dopaminergic neurons. J. Neurochem. 124 (2), 250-261 (2013).
  34. Kim, A. M., Vogt, S., O’Halloran, T. V., Woodruff, T. K. Zinc availability regulates exit from meiosis in maturing mammalian oocytes. Nature Chemical Biology. 6 (9), 674-681 (2010).
  35. Ortega, R., Cloetens, P., Deves, G., Carmona, A., Bohic, S. Iron storage within dopamine neurovesicles revealed by chemical nano-imaging. PloS One. 2 (9), (2007).
  36. Bohic, S., et al. Synchrotron hard X-ray microprobe: fluorescence imaging of single cells. Appl. Phys. Lett. 78 (22), 3544-3546 (2001).
  37. Kosior, E., et al. Combined use of hard X-ray phase contrast imaging and X-ray fluorescence microscopy for sub-cellular metal quantification. J. Struct. Biol. 177 (2), 239-247 (2012).
  38. Glesne, D., Vogt, S., Maser, J., Legnini, D., Huberman, E. Regulatory properties and cellular redistribution of zinc during macrophage differentiation of human leukemia cells. J. Struct. Biol. 155 (1), 2-11 (2006).
  39. McRae, R., Lai, B., Vogt, S., Fahrni, C. J. Correlative microXRF and optical immunofluorescence microscopy of adherent cells labeled with ultrasmall gold particles. J. Struct. Biol. 155 (1), 22-29 (2006).
  40. Yang, L., et al. Imaging of the intracellular topography of copper with a fluorescent sensor and by synchrotron x-ray fluorescence microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (32), 11179-11184 (2005).
  41. Wagner, D., et al. Elemental analysis of Mycobacterium avium-, Mycobacterium tuberculosis-, and Mycobacterium smegmatis-containing phagosomes indicates pathogen-induced microenvironments within the host cell’s endosomal system. J. Immunol. 174 (3), 1491-1500 (2005).
  42. Harris, H. H., et al. Time-dependent uptake, distribution and biotransformation of chromium(VI) in individual and bulk human lung cells: application of synchrotron radiation techniques. Journal Of Biological Inorganic Chemistry : JBIC : a publication of the Society of Biological Inorganic Chemistry. 10 (2), 105-118 (2005).
  43. Corezzi, S., et al. Synchrotron-based X-ray fluorescence imaging of human cells labeled with CdSe quantum dots. Anal. Biochem. 388 (1), 33-39 (2009).
  44. Marmorato, P., et al. Cellular distribution and degradation of cobalt ferrite nanoparticles in Balb/3T3 mouse fibroblasts. Toxicol. Lett. 207 (2), 128-136 (2011).
  45. Weekley, C. M., et al. distribution, and speciation of selenoamino acids by human cancer cells: X-ray absorption and fluorescence methods. Bioquímica. 50 (10), 1641-1650 (2011).
  46. Yuan, Y., et al. Epidermal growth factor receptor targeted nuclear delivery and high-resolution whole cell X-ray imaging of Fe3O4@TiO2 nanoparticles in cancer cells. ACS Nano. 7 (12), 10502-10517 (2013).
  47. McRae, R., Bagchi, P., Sumalekshmy, S., Fahrni, C. J. In situ imaging of metals in cells and tissues. Chem. Rev. 109 (10), 4780-4827 (2009).
  48. Carter, E. A., et al. Silicon nitride as a versatile growth substrate for microspectroscopic imaging and mapping of individual cells. Molecular Biosystems. 6 (7), 1316-1322 (2010).

Tags

X-ray Fluorescence ImagingChemical FixationAdherent CellsMetal DistributionCryo-fixationAldehyde FixationChemical BiologyMaterials ScienceGeoscienceCultural Heritage

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Finney, L. A., Jin, Q. Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation. J. Vis. Exp. (97), e52370, doi:10.3791/52370 (2015).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image