Calibrato forcipe Modello di Spinal Cord Injury Compression

Tutte le procedure di animali e metodi di cura degli animali devono essere approvati dalla Institutional Animal Care and Usage Comitato dell'istituzione (IACUC). 1. Preparazione chirurgica Montare tutti gli strumenti chirurgici necessari e reagenti: pinze, forbici Vana, roungeurs, divaricatore, bisturi, forbici, suture, graffette cutanee, Q-tips, saline sterili, spugne chirurgiche e isoflurano. Preparare e autoclave un pacchetto completo di strumenti chirurgici prima dell'intervento. Se l'esecuzione di interventi chirurgici su più di un mouse, preparare e autoclave un pacchetto di strumenti per animale, o in autoclave una bustina di strumenti chirurgici e sterilizzazione con uno sterilizzatore strumento tra ambulatori. Generalmente, un pacchetto di strumenti sterilizzati può essere utilizzato su un massimo di 5 topi se viene utilizzato un utensile terilizer perle di vetro per pulire strumenti in-tra ambulatori (dopo 5 animali gli utensili devono essere nuovamente puliti e sterilizzati prima dell'uso). Si prega di verificare con l'amministratore IACUC locale per institutisugli orientamenti specifici. Sterilizzare il campo chirurgico con il 70% cotone imbevuto di alcol isopropilico. Impostare teli chirurgici al fine di garantire un campo sterile viene mantenuta durante l'intervento chirurgico. Pesare ogni mouse prima dell'intervento. Somministrare una dose di 0,05 mg / kg di peso corporeo di buprenorfina, sottocutanea. Anestetizzare l'animale somministrando isoflurano alla dose di 4% nella camera di induzione della macchina isoflurano. Una volta che l'animale è anestetizzato, applicare una pomata per gli occhi per prevenire la disidratazione, impostare l'animale su una piastra elettrica a 37 ° C, e di garantire che la testa del mouse è situato correttamente nel cono anestesia. (Nota: utilizzare una fonte di calore tale da non causare ustioni termiche, cioè, una coperta acqua circolante, bottiglia di acqua calda, o equivalente.). A questo punto amministrare una dose di 2% isoflurano per l'animale. Radere la superficie dorsale del mouse, di circa 1 cm di tutto il percorso dell'incisione previsto. Disinfettare l'incisione site lavando con il 70% cotone imbevuto di alcol isopropilico, quindi con una soluzione di iodio (10% Povidone-iodio, 1% a disposizione di iodio). Ripetere 3 volte. 2. Dorsale Laminectomy Prima di effettuare una incisione, assicurarsi che l'animale sia adeguatamente anestetizzato controllando per i riflessi con il metodo pizzico punta o la coda. Fare un'incisione lungo la spina dorsale, con bisturi e la lama, e quindi controllare i riflessi di nuovo. Arco la schiena per aiutare correttamente visualizzare i punti di riferimento, come i confini tra le vertebre. Tagliare attraverso la pelle. Inserire divaricatore per mantenere la pelle e la fascia posteriore del midollo spinale. Eliminare il tessuto su entrambi i lati del midollo spinale per esporre i muscoli che coprono la colonna vertebrale. NOTA: Il chirurgo deve avere familiarità con i punti di riferimento anatomici. Ad esempio, l'angolo inferiore della scapola corrisponde T7. La parte superiore della curva naturale della colonna vertebrale del mouse è T12 e può essere utilizzato come punto di riferimento. Con pilluminazione roper, determinare lo spazio tra le vertebre. Trova l'estremità posteriore del T10 e tagliare i muscoli e la fascia perpendicolare lo spazio su disco intervertebrale. Tagliare appena sufficiente per esporre il processo e posteriore lamina spinoso di T10. Utilizzando un paio di punta fine Dumont # 5 pinze, rimuovere alcuni dei tessuti dalla lamina e processo spinoso per esporre un piccolo frammento del midollo spinale. Quando necessario, utilizzare pinze tessuto per stabilizzare la colonna vertebrale. Eseguire la laminectomia inserendo un lato di un paio di forbici piccole vana lungo il lato dorsolateral della vertebra e appena sotto la lamina. Fare piccoli tagli attenzione a tagliare attraverso il lato laterale della lamina vertebrale. Assicurarsi che non viene applicata pressione al midollo spinale. Ripetere sull'altro lato. Applicare una leggera pressione per fermare il sanguinamento, se necessario, con un Q-tip o una spugna chirurgica, facendo attenzione a non esercitare pressione sul midollo spinale. NOTA: Preparare schiuma gelimbevuto in soluzione fisiologica sterile nel caso in cui le esigenze sanguinamento da controllare. Una volta effettuate le incisioni, sollevare la parte dorsale della vertebra ed eliminare delicatamente eventuali allegati tessuto. Utilizzare mezzi adeguati per controllare il sanguinamento, se necessario. 3. Spinal Cord Compression Utilizzando roungeurs o pinze laminectomia, assicurano che i lati laterali del midollo spinale sono liberi di osso vertebrale in modo che la pinza calibrate per il pregiudizio compressione possono collocare su entrambi i lati del midollo spinale. I bracci della pinza devono poter essere posizionato nello spazio epidurale su lati adiacenti del midollo spinale e le punte della pinza deve essere in grado di raggiungere il piano del canale vertebrale. Assicurarsi che la visibilità del midollo spinale è buona. Collocare la calibrato Dumont # 5 pinze circa a metà del segmento esposto del midollo spinale. Ricordiamo che i bracci della forzaps deve essere posizionato nello spazio epidurale su lati adiacenti e le punte deve toccare il pavimento del canale vertebrale per generare lesioni riproducibili. Comprimere delicatamente il midollo spinale fino ai distanziali connettono. Mantenere in posizione per 15 secondi. Rilasciare delicatamente la forza di compressione e rimuovere la pinza calibrate dal midollo spinale. Salina sterile deve essere utilizzato per riguadagnare omeostasi prima che la ferita è chiusa. 4. Ferita chiusura Suturare con attenzione lo strato muscolare sopra il midollo spinale, facendo attenzione a non interrompere o esercitare pressione sul midollo spinale. Utilizzare sia suture o graffette per chiudere la pelle sulla ferita. Se si utilizza il gas anestetico, cominciare a cono / disattivare l'anestetico. Somministrare 0,1 ml di Ringer lattato per 10 g di peso corporeo per aiutare conto per la disidratazione durante l'intervento chirurgico e dopo l'intervento, quando l'animale è letargico e recuperando dall'infortunio. La soluzione deve essere warmed alla temperatura corporea prima dell'iniezione. Posizionare il mouse in una gabbia-assestamento libero. La gabbia deve poggiare su di un rilievo di riscaldamento (come descritto in 1.1.5) in un modo che consente la metà della superficie della gabbia sia sul pad, mentre l'altra metà è appoggiato su un contatore RT, per dare la topo opzioni clima una volta che è ambulatoriale. Fate attenzione che la "gabbia di recupero" si trova in un ambiente tranquillo. Strettamente monitorare l'animale finché non ha ripreso conoscenza, momento in cui il mouse può essere trasferita ad una gabbia regolare con biancheria. Cura 5. Post-operatorio Dopo l'intervento chirurgico, somministrare una dose di 0,05 mg / kg di peso corporeo buprenorfina per via sottocutanea ogni 12 ore per i primi 3 giorni dopo l'intervento, e poi, se necessario per gestire i sintomi di dolore. Somministrare una dose di Ringer lattato (0,1 ml per 10 g di peso corporeo per via sottocutanea) per i primi 3 – 5 giorni dopo l'intervento. Dare questa dose se / quando l'unaimal comincia a mostrare segni di disidratazione di fuori di questo periodo di tempo iniziale. Esprimere manualmente la vescica degli animali con la manovra di Crede due volte al giorno. Palpate delicatamente addome dell'animale per individuare la vescica, e quindi applicare una leggera pressione verso il basso fino a quando la vescica è vuota. Se la vescica non si svuota o urine è sanguinante o nuvoloso, somministrare 50 mg / kg di peso corporeo del Baytril all'animale tramite iniezione interperitoneal per 10 giorni. Monitorare animali per i segni di autofagia, disidratazione e perdita di peso eccessivo (superiore al 20% del peso corporeo). Se un animale sperimenta uno di questi sintomi si prega di consultare un veterinario immediatamente per quanto riguarda le opzioni di trattamento, o eutanasia l'animale in modo umano seguendo le linee guida IACUC. Dato che la mobilità può essere limitata a destra dopo l'intervento chirurgico, prendere le misure necessarie per assicurarsi che gli animali abbiano accesso al cibo e all'acqua. Pre-confezionati cibo umido, come pure uns idrogel, può essere reso disponibile per gli animali in questi casi. 6. valutare i danni ai tessuti conseguenti a compressione Injury Anestetizzare animale come descritto ai punti 1.4 e 1.5. Controllare la profondità di anestesia pizzico punta e monitoraggio riflessi del trigemino corneali. Quando l'animale è insensibile agli stimoli, passare al punto 6.2. Eseguire una perfusione intracardial 10. Esporre la cavità toracica e inserire un ago nel ventricolo sinistro. Sciacquare fluidi esistenti con 20 – 30 ml di fosfato ghiacciata salina tamponata (PBS), seguita da 15 – 25 ml di ghiacciata 4% paraformaldeide (PFA). Rimuovere il midollo spinale. Tagliare la pelle dorsale del midollo spinale e eliminare qualsiasi tessuto in eccesso che circonda la lunghezza della colonna vertebrale. Excise colonna vertebrale e tagliare via qualsiasi tessuto rimanente. Il livello attuale del laminectomia e honjury può essere confermata contando costole. Usare le forbici Vanna e pinze a spostare piccole sezioni della colonna vertebrale in senso caudale-to-rostrale. Continuare a tagliare fino a quando il cavo è esposto sufficiente per consentire la rimozione sicura. Visualizzazione della posizione e processo di taglio può essere facilitata attraverso l'utilizzo di uno stereoscopio. Collocare il tessuto del midollo spinale in 4% PFA. Lasciare tessuto post-fix in questa soluzione per 24 ore a 4 ° C. Tessuto Cryoprotect incubando nel 30% di saccarosio per 24 ore a 4 ° C. Incorpora tessuti in ottobre In breve, prendere il tessuto dal incubazione di saccarosio del 30% e rimuovere qualsiasi soluzione in eccesso. Collocare il tessuto in una cryomold pieno di ottobre e incubare per 1 ora a 4 ° C. Rimuovere muffa da 4 ° C, confermare l'orientamento direzionale del tessuto, mettere lo stampo in un piatto di 2-metilbutano superficiale (pre-raffreddata per 1 ora in ghiaccio secco) e lasciare Office per solidificare completamente. Continuate a ghiaccio secco se si utilizza immediatamente o STOnuovamente a -80 ° C. Tagliare il tessuto in 20 sezioni micron sagittali con un criostato. Mount tessuto direttamente su vetrini. Conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso. Eseguire ematossilina e eosina (H & E) macchia. In breve, reidratare il tessuto (5 min, 2 volte), macchia con ematossilina (2,5 min), e lavare con acqua (1 min, 2 volte). Incubare tessuti nel 50% e poi 70% di etanolo (3 min ciascuno), macchia con eosina (45 sec), e disidratare mediante incubazione a 90% (5 sec), 95% (5 sec), 100% etanolo (2 min) , e isopropanolo (2 min). Cancella con xilene (5 min, 3 volte). NOTA: H & E colorazione varia a seconda dello spessore e delle condizioni tessuto specifico. Pertanto, la standardizzazione è necessaria prima di procedere con tessuti sperimentali campioni. Coprire il tessuto con una sottile striscia di Permount (~ 100 micron) e coprioggetto. Premere verso il basso tutti i lati del coprioggetto per garantire la corretta distribuzione del fluido. Lasciate asciugare i vetrini O / N. Visualize sezioni di tessuto con un microscopio e cattura immagini digitali utilizzando il software in dotazione.