Всего монтажа Визуализация эмбриона мыши Сенсорная Axon прогнозам
Summary
We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.
Abstract
Визуализация нейронных проекций полнометражных эмбрионов необходимо получить представление о том, как у млекопитающих развивать нейронных сетей. Здесь мы опишем метод маркировать на месте подмножество спинной ганглий корень (DRG) аксонов прогнозов для оценки их фенотипические характеристики, используя несколько генетически модифицированных линий мышей. В TrkA-положительных нейронов нейроны ноцицептора, предназначенные для передачи сигналов боли. Мы используем мыши линии TrkA taulacZ для обозначения траектории всех TrkA-положительных периферийных аксонов в неповрежденной эмбриона мыши. Мы дополнительно разводить TrkA taulacZ линию на Bax нулевой фон, который, по существу отменяет апоптоза нейронов, с целью оценки роста, связанных с вопросы независимо от возможных последствий генетических манипуляций на выживание нейронов. Впоследствии, генетически модифицированные мыши, представляющие интерес, разводят с TrkA ЦаулACZ / Bax нулевая линия и готовы для исследования с использованием методов, описанных в данном документе. Данная презентация содержит подробную информацию о планах мыши размножения, генотипирование на момент вскрытия, подготовки ткани, окрашивание и очистки, чтобы для визуализации полнометражных аксонов траекторий в целом монтажа подготовки.
Introduction
Установление точного нейронных сетей представляет собой сложный процесс развития необходимы для функциональности нервной системы. Нарушение этого процесса приводит к нейронной дисфункции, который был вовлечен в неврологических заболеваний человека 1-3. Для изучения основополагающих молекулярных механизмов роста аксонов и целевой иннервации у млекопитающих, мы разработали протокол для визуализации аксонов траектории TrkA-выражения сенсорных нейронов, используя комбинацию из двух генетически модифицированных линий мышей.
TrkA является рецептором для фактора роста нервов NGF и функциональный маркер ноцицептивных сенсорных нейронов 4. TrkA высоко экспрессируется в ноцицептивных нейронов во время раннего развития и посредником NGF-зависимое выживание нейронов, роста аксонов, разветвление и целевой иннервации 5-9. У мышей TrkA taulacZ, дикого типа гена TrkA заменен экспрессии taulacZ сassette 10, таким образом, что аксонов морфологии предполагаемых TrkA-позитивных нейронов могут быть визуализированы с помощью β-гал (X-GAL) окрашивания 11. Использование гетерозиготную линию TrkA taulacZ / WT, мы можем рассмотреть факторы, которые могут регулировать или помешать с развитием сенсорных афферентных проекций в естественных условиях.
Кроме того, выражение TrkA отсутствует у гомозиготных мышей TrkA taulacZ / taulacZ, которые, следовательно, могут быть использованы для оценки роста аксонов способствуя механизмов в отсутствие ФРН сигнализации / TrkA. С ноцицептивных нейронов зависит от NGF / TrkA сигнализации не только для роста аксонов, но и для выживания, мы используем другую линию мыши, не имея проапоптотического ген Bax, ингибируют апоптоз в эмбриональных нейронов DRG, спасая их от гибели клеток, что в противном случае наблюдается при отсутствии сигналов TrkA. Вах – / – фон 12 Таким образом, позволяет molecuLAR рассечение пути, непосредственно затрагивающих аксонов 7-9,13-15 роста сигнализации. В TrkA – / -: Вах – / – мышей, DRG нейроны выжить, но сенсорная афферентная иннервация в коже полностью отменена 14,15. Мы можем избирательно активировать сигнальные пути, чтобы определить их соответствующие взносы в развитие аксонов прогнозов. Полезность этого метода является то, что он позволяет оценить изменения в аксонов фенотипов роста, когда различные генетические модификации разводят на TrkA taulacZ / taulacZ: Вах – / – или TrkA taulacZ / WT: Вах – / – фоны.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный выше X-гал процедура окрашивания эмбриональных мышей TrkA taulacZ позволяет быстро и детальной визуализации на большие расстояния аксонов прогнозов в интактном фиксированной эмбриона. Из-за Вах нулевой фоне этих мышей позволит для зондирования механизмы, которые …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить доктора Луи Рейхардт для мышей TrkA taulacZ и д-р Аннет Markus для проницательного обсуждения и предложений. Эта работа была поддержана запуска средства из Берк Фонда, а также Уайтхолл исследовательского фонда грант 2010-08-61, исследовательский грант от Крылья для жизни фонда (WFL-US-028/14), грант ZB1-1102-1 от Кристофер и Дана Рив Фонд и гранты 1R01EY022409 и 3R01EY022409-01S1 из Национального института глаза, к JZ. KJo является членом Голдсмит.
Materials
| Company | Catalog Number | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 |
| PBS | Life Tech | 10010-023 |
| Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B |
| Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B |
| Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 |
| Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 |
| Incubator | Labline | Model 120 |
| Insect pins | FST | 26000-30 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 |
| 6 well dish | USA Scientific | CC7672-7506 |
| Primers | IDT | custom DNA primers |
| Takara dNTP mixture | Takara | 4030 |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A |
| PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 |
| Dissecting microscope | Leica | M205A |
| Camera | Leica | DFC310FX |
| Ring light | Leica | MEB110 |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
Referencias
- Verze, L., et al. Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV. Neurology. 55, 126-128 (2000).
- Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents with complex regional pain syndromes. Pain. 131, 153-161 (2007).
- Uceyler, N., et al. Small fibers in Fabry disease: baseline and follow-up data under enzyme replacement therapy. J Peripher Nerv Syst. 16, 304-314 (2011).
- Reichardt, L. F., Mobley, W. C. Going the distance, or not, with neurotrophin signals. Cell. 118, 141-143 (2004).
- White, F. A., et al. Synchronous onset of NGF and TrkA survival dependence in developing dorsal root ganglia. J Neurosci. 16, 4662-4672 (1996).
- Farinas, I., Wilkinson, G. A., Backus, C., Reichardt, L. F., Patapoutian, A. Characterization of neurotrophin and Trk receptor functions in developing sensory ganglia: direct NT-3 activation of TrkB neurons in vivo. Neuron. 21, 325-334 (1998).
- Markus, A., Zhong, J., Snider, W. D. Raf and akt mediate distinct aspects of sensory axon growth. Neuron. 35, 65-76 (2002).
- Kuruvilla, R., et al. A neurotrophin signaling cascade coordinates sympathetic neuron development through differential control of TrkA trafficking and retrograde signaling. Cell. 118, 243-255 (2004).
- Zhong, J., et al. Raf kinase signaling functions in sensory neuron differentiation and axon growth in vivo. Nature. 10, 598-607 (2007).
- Bulfone, A., et al. An olfactory sensory map develops in the absence of normal projection neurons or GABAergic interneurons. Neuron. 21, 1273-1282 (1998).
- Moqrich, A., et al. Expressing TrkC from the TrkA locus causes a subset of dorsal root ganglia neurons to switch fate. Nature. 7, 812-818 (2004).
- Knudson, C. M., Tung, K. S., Tourtellotte, W. G., Brown, G. A., Korsmeyer, S. J. Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death. Science. 270 (5233), 96-99 (1995).
- Lentz, S. I., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., Snider, W. D. Neurotrophins support the development of diverse sensory axon morphologies. J. Neurosci. 19, 1038-1048 (1999).
- Patel, T. D., Jackman, A., Rice, F. L., Kucera, J., Snider, W. D. Development of sensory neurons in the absence of NGF/TrkA signaling in vivo. Neuron. 25, 345-357 (2000).
- Donovan, K. J., et al. B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS. The Journal of experimental medicine. 211, 801-814 (2014).
- Mercer, K., et al. Expression of endogenous oncogenic V600EB-raf induces proliferation and developmental defects in mice and transformation of primary fibroblasts. Cancer research. 65, 11493-11500 (2005).
- Tronche, F., et al. Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety. Nature genetics. 23, 99-103 (1999).
- Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
- Feng, G., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. DiI-labeling of DRG neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord. J Vis Exp. , (2011).
