We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.
embriyolarda tam uzunlukta nöronal projeksiyonlar görselleştirme nöronal ağlar nasıl geliştiğini memeli bir anlayış kazanmak esastır. Burada yerinde birkaç genetik manipüle fare hatları kullanarak fenotipik özelliklerini değerlendirmek için dorsal kök ganglion (DRG) akson projeksiyonlar bir alt kümesini etiketlemek için bir yöntem açıklanmaktadır. TrkA pozitif nöronların ağrı sinyallerinin iletimi için özel nosiseptör nöronlar vardır. Biz sağlam fare embriyo tüm TrkA-pozitif çevresel akson yörüngeleri etiketlemek için bir TrkA taulacZ fare hattını kullanmak. Biz daha bağımsız nöronal sağkalım üzerine genetik manipülasyonlar olası etkilerinin büyüme ile ilgili soruları değerlendirmek amacıyla, esasen nöronal apoptoz ortadan kaldıran bir Bax boş bir arka plan üzerine TrkA taulacZ hattını doğurmak. Daha sonra, ilgi genetiği değiştirilmiş fareler TrkA Taul ile yetiştirilenACZ / Bax boş hattı ve daha sonra burada tarif edilen teknikler kullanılarak çalışma için hazırdır. Bu sunum, tüm montaj hazırlanmasında tam uzunlukta aksonal yörüngeleri görünüm için izin diseksiyon, doku hazırlanması, boyama ve temizleme sırasında detaylı fare üreme planları hakkında bilgi, genotiplendirmesi içerir.
Kesin nöronal ağların kurulması sinir sisteminin işlevselliği için gerekli karmaşık bir gelişimsel süreçtir. Bu süreçte sorunlar olduğu insan nörolojik hastalıklar 1-3 implike edilmiştir nöronal fonksiyon bozukluğuna yol açar. Memelilerde akson büyümesi ve hedef innervasyon yatan moleküler mekanizmaları incelemek için, iki genetiği değiştirilmiş fare hatları bir arada kullanarak duyusal nöronlar TrkA-ifade aksonal yörüngeleri görselleştirmek için bir protokol geliştirmiştir.
TrkA sinir büyüme faktörü NGF için bir alıcı, ve nosiseptif duyu nöronlarının 4 fonksiyonel bir işaretleyici olarak kullanılabilir. TrkA derece erken gelişimi sırasında nosiseptif nöronların ifade ve NGF-bağımlı nöron hayatta kalma, akson büyümesini, arborization ve hedef innervasyon 5-9 aracılık eder. TrkA taulacZ farelerde, vahşi tip TrkA geninin taulacZ sentezleme c değiştirilirfarazi TrkA pozitif nöronlarının akson morfolojisi 11 boyama β-gal (X-gal) ile görüntülenebilir şekilde assette 10. Heterozigot TrkA taulacZ / WT hattını kullanarak, düzenlemek veya in vivo duyusal afferent projeksiyonlar gelişmesine engel olabilir faktörleri inceleyebilirsiniz.
Ayrıca, TrkA ifadeleri, bu nedenle, NGF / TrkA sinyal olmadığında mekanizmaları teşvik akson büyümesini belirlemek üzere kullanılabilir homozigot TrkA taulacZ / taulacZ farelerde, yoktur. Nosiseptif nöronlar, NGF / TrkA sadece akson büyümesi için sinyal bağlı olduklarından, aynı zamanda hayatta kalmak için, başka türlü hücre ölümden kurtarmak, embriyonik DRG nöronlarının apoptosisi engellemek için, pro-apoptotik Bax geni eksik bir fare hattı kullanır TrkA sinyallemesinin yokluğunda gözlemlenen. Bax – / – Arka plan 12 Böylece molecu sağlarözellikle akson büyüme 7-9,13-15 etkileyen sinyal yollarının lar diseksiyonu. TrkA yılında – / -: Bax – / – fareler, DRG nöronlar hayatta, ama deride duyu afferent innervasyon tamamen 14,15 kaldırılmıştır. Biz seçici akson projeksiyonlar gelişmesine kendi katkılarını belirlemek için sinyal yolları aktive edebilirsiniz. Bu yöntemin yarar farklı genetik değişiklikler TrkA taulacZ / taulacZ üzerine yetiştirilen zaman aksonal büyüme fenotipleri değişikliklerin değerlendirilmesine olanak sağlamasıdır: Bax – / – veya TrkA taulacZ / WT: Bax – / – kökenden.
Embriyonik TrkA taulacZ farelerin yukarıda tarif edilen X-gal lekeleme prosedürü sağlam, sabit embriyo uzun mesafe akson çıkıntıların hızlı ve ayrıntılı olarak gösterebilir. Bu fareler akson büyümesi ve nöronal hayatta hem de katkıda bulunabilir mekanizmalar sinyal tarama izin Bax boş arka plan Çünkü. Ilgi transgenik veya nakavt fareler ile çiftleşme aksonal fenotip kapsamlı değerlendirilmesi için izin verir ve daha detaylı bir şekilde akson büyüme sinyalini i…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar anlayışlı tartışma ve önerileriniz için TrkA taulacZ fareler Dr. Annette Markus Dr. Louis Reichardt teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Burke Vakfı yanı sıra Whitehall Vakfı araştırma bursu 2010-08-61, Yaşam Vakfı (WFL-ABD-028/14) için Wings bir araştırma hibe başlangıç fonları tarafından desteklenen, gelen ZB1-1102-1 hibe Christopher & Dana Reeve Vakfı, ve JZ Ulusal Göz Enstitüsü hibe 1R01EY022409 ve 3R01EY022409-01S1. KJO bir Goldsmith üyesidir.
Company | Catalog Number | |
PFA | Sigma-Aldrich | P6418 |
PBS | Life Tech | 10010-023 |
Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B |
Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B |
Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C |
X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 |
Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 |
Incubator | Labline | Model 120 |
Insect pins | FST | 26000-30 |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 |
6 well dish | USA Scientific | CC7672-7506 |
Primers | IDT | custom DNA primers |
Takara dNTP mixture | Takara | 4030 |
Takara LA buffer | Takara | RR002A |
Takara LA Taq | Takara | RR002A |
PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad |
Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 |
Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 |
Dissecting microscope | Leica | M205A |
Camera | Leica | DFC310FX |
Ring light | Leica | MEB110 |
Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |