Hel-mount Imaging av Mouse Embryo Sensory Axon Anslag
Summary
We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.
Abstract
Visualisering av helaftens nevronale anslag i embryoer er viktig å få en forståelse av hvordan pattedyr nevrale nettverk utvikle. Her beskriver vi en metode for å merke in situ en undergruppe av dorsal root ganglion (DRG) axon anslag for å vurdere deres fenotypiske egenskaper ved hjelp av flere genetisk manipulerte mus linjer. TrkA-positive nevroner er nociceptor nevroner, dedikert til overføring av smerte signaler. Vi bruker et TrkA taulacZ mus linje å merke baner av alle trkA–positive perifere axoner i intakt museembryo. Vi avler videre TrkA taulacZ linje på en Bax null bakgrunn, som i hovedsak opphever nerveapoptose, for å vurdere vekstrelaterte spørsmål uavhengig av mulige effekter av genetiske manipulasjoner på neuronoverlevelse. Deretter blir genmodifiserte mus av interesse avlet med TrkA TaulACZ / Bax null linje og er deretter klar for studien ved hjelp av teknikker som er beskrevet her. Denne presentasjonen inneholder detaljert informasjon om muse avl planer, genotyping på tidspunktet for disseksjon, vev forberedelse, beising og rydding for å tillate visualisering av helaftens aksonale baner i hel-mount forberedelse.
Introduction
Etablering av presise nevrale nettverk er en kompleks utviklingsprosess viktig for funksjonaliteten av nervesystemet. Forstyrrelse i denne prosessen fører til nevronal dysfunksjon, som har vært implisert i humane nevrologiske sykdommer 1-3. Å studere de underliggende molekylære mekanismene for axon vekst og mål innervasjon i pattedyr, har vi utviklet en protokoll for å visualisere de aksonale baner av TrkA-uttrykke sensoriske nevroner ved bruk av en kombinasjon av to genmodifiserte mus linjer.
TrkA er en reseptor for NGF nervevekstfaktor, og er en funksjonell markør for nociceptive sensoriske nevroner 4. TrkA er sterkt uttrykt i nociceptive nevroner under tidlig utvikling og formidler NGF-avhengige nevron overlevelse, axon vekst, arborization og mål innervation 5-9. I TrkA taulacZ mus, er villtype TrkA-genet erstattet med et taulacZ ekspresjon cAssette 10, slik at aksonal morfologi putative trkA-positive nevroner kan visualiseres ved β-gal (X-gal) farging 11. Ved hjelp av en heterozygot TrkA taulacZ / WT linje, kan vi undersøke faktorer som kan regulere eller forstyrre utviklingen av sensoriske afferente anslag in vivo.
Videre er TrkA ekspresjon fraværende i homozygot TrkA taulacZ / taulacZ mus, som derfor kan brukes til å vurdere axon vekstfremmende mekanismer i fravær av NGF / TrkA signalering. Siden nociceptive neuroner avhenger av NGF / TrkA signalering, ikke bare for axon vekst, men også for å overleve, anvender vi en annen muselinje som mangler den pro-apoptotiske Bax-genet, for å hemme apoptose i embryonale DRG-neuroner, redning dem fra celledød som ellers observert i fravær av TrkA signalering. Den Bax – / – bakgrunn 12 tillater dermed for molecuLar disseksjon av signalveier som spesifikt påvirker axon vekst 7-9,13-15. I TrkA – / -: Bax – / – mus, DRG nevroner overleve, men sensorisk afferent innervasjon i huden er fullstendig avskaffet 14,15. Vi kan selektivt aktivere signalveier å bestemme sine respektive bidrag til utviklingen av axon anslag. Nytten av denne fremgangsmåte er at den gjør det mulig å vurdere endringer i aksonal vekstfenotyper når forskjellige genetiske modifikasjoner er avlet på TrkA taulacZ / taulacZ: Bax – / – eller TrkA taulacZ / WT: Bax – / – bakgrunner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den ovenfor beskrevne X-gal-farging Måten i embryonale TrkA taulacZ mus muliggjør den raske og detaljert visualisering av lang avstand axon spring i intakt fast embryo. På grunn av den Bax null bakgrunns disse musene tillate for sondering av signaleringsmekanismer som kan bidra til både axon vekst og neuronal overlevelse. Parring med transgene eller knockout mus av interesse åpner for omfattende vurdering av aksonale fenotyper og kan tjene som nyttig guide for fremtidige eksperimenter f…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Dr. Louis Reichardt for TrkA taulacZ mus og Dr. Annette Markus for innsiktsfull diskusjon og forslag. Dette arbeidet ble støttet av oppstart midler fra Burke Foundation samt Whitehall Foundation forskningsstipend 2010-08-61, et forskningsstipend fra Wings for Life Foundation (WFL-US-028/14), gi ZB1-1102-1 fra Christopher & Dana Reeve Foundation, og tilskudd 1R01EY022409 og 3R01EY022409-01S1 fra National Eye Institute, til JZ. KJo er en Goldsmith stipendiat.
Materials
| Company | Catalog Number | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 |
| PBS | Life Tech | 10010-023 |
| Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B |
| Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B |
| Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 |
| Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 |
| Incubator | Labline | Model 120 |
| Insect pins | FST | 26000-30 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 |
| 6 well dish | USA Scientific | CC7672-7506 |
| Primers | IDT | custom DNA primers |
| Takara dNTP mixture | Takara | 4030 |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A |
| PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 |
| Dissecting microscope | Leica | M205A |
| Camera | Leica | DFC310FX |
| Ring light | Leica | MEB110 |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
Referencias
- Verze, L., et al. Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV. Neurology. 55, 126-128 (2000).
- Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents with complex regional pain syndromes. Pain. 131, 153-161 (2007).
- Uceyler, N., et al. Small fibers in Fabry disease: baseline and follow-up data under enzyme replacement therapy. J Peripher Nerv Syst. 16, 304-314 (2011).
- Reichardt, L. F., Mobley, W. C. Going the distance, or not, with neurotrophin signals. Cell. 118, 141-143 (2004).
- White, F. A., et al. Synchronous onset of NGF and TrkA survival dependence in developing dorsal root ganglia. J Neurosci. 16, 4662-4672 (1996).
- Farinas, I., Wilkinson, G. A., Backus, C., Reichardt, L. F., Patapoutian, A. Characterization of neurotrophin and Trk receptor functions in developing sensory ganglia: direct NT-3 activation of TrkB neurons in vivo. Neuron. 21, 325-334 (1998).
- Markus, A., Zhong, J., Snider, W. D. Raf and akt mediate distinct aspects of sensory axon growth. Neuron. 35, 65-76 (2002).
- Kuruvilla, R., et al. A neurotrophin signaling cascade coordinates sympathetic neuron development through differential control of TrkA trafficking and retrograde signaling. Cell. 118, 243-255 (2004).
- Zhong, J., et al. Raf kinase signaling functions in sensory neuron differentiation and axon growth in vivo. Nature. 10, 598-607 (2007).
- Bulfone, A., et al. An olfactory sensory map develops in the absence of normal projection neurons or GABAergic interneurons. Neuron. 21, 1273-1282 (1998).
- Moqrich, A., et al. Expressing TrkC from the TrkA locus causes a subset of dorsal root ganglia neurons to switch fate. Nature. 7, 812-818 (2004).
- Knudson, C. M., Tung, K. S., Tourtellotte, W. G., Brown, G. A., Korsmeyer, S. J. Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death. Science. 270 (5233), 96-99 (1995).
- Lentz, S. I., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., Snider, W. D. Neurotrophins support the development of diverse sensory axon morphologies. J. Neurosci. 19, 1038-1048 (1999).
- Patel, T. D., Jackman, A., Rice, F. L., Kucera, J., Snider, W. D. Development of sensory neurons in the absence of NGF/TrkA signaling in vivo. Neuron. 25, 345-357 (2000).
- Donovan, K. J., et al. B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS. The Journal of experimental medicine. 211, 801-814 (2014).
- Mercer, K., et al. Expression of endogenous oncogenic V600EB-raf induces proliferation and developmental defects in mice and transformation of primary fibroblasts. Cancer research. 65, 11493-11500 (2005).
- Tronche, F., et al. Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety. Nature genetics. 23, 99-103 (1999).
- Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
- Feng, G., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. DiI-labeling of DRG neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord. J Vis Exp. , (2011).
