Whole-monter imagerie de l'embryon de souris projections sensorielles Axon
Summary
We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.
Abstract
La visualisation de pleine longueur projections neuronales dans les embryons est essentiel d'acquérir une compréhension de la façon dont les mammifères réseaux neuronaux se développent. Nous décrivons ici un procédé pour marquer in situ un sous-ensemble de ganglion de la racine dorsale (DRG) de projections axonales à évaluer leurs caractéristiques phénotypiques utilisant plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées. Les neurones TrkA-positif sont des neurones nocicepteurs, dédiées à la transmission des signaux de douleur. Nous utilisons une lignée de souris TrkA taulacZ d'étiqueter les trajectoires de tous les axones périphériques TrkA-positif dans l'embryon de souris intactes. Nous élevons en outre la ligne TrkA taulacZ sur un fond nul Bax, qui abolit essentiellement apoptose neuronale, afin d'évaluer les questions indépendamment de possibles effets de manipulations génétiques sur la survie neuronale liés à la croissance. Par la suite, les souris génétiquement modifiées d'intérêt sont élevés avec le TrkA TaullacZ / Bax ligne nulle et sont alors prêts pour l'étude en utilisant les techniques décrites ici. Cette présentation contient des informations détaillées sur les plans d'élevage de souris, le génotypage au moment de la dissection, la préparation des tissus, la coloration et la compensation pour permettre la visualisation de pleine longueur trajectoires axonales dans l'ensemble du montage préparation.
Introduction
Mise en place des réseaux neuronaux précis est un processus complexe du développement essentiel pour le fonctionnement du système nerveux. La perturbation de ce processus conduit à un dysfonctionnement neuronal qui a été impliquée dans des maladies neurologiques humaines 3.1. Pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents de la croissance axonale et la cible innervation chez les mammifères, nous avons développé un protocole de visualiser les trajectoires axonales de TrkA exprimant neurones sensoriels utilisant une combinaison de deux lignées de souris génétiquement modifiées.
TrkA est un récepteur pour le facteur NGF de croissance des nerfs et est un marqueur fonctionnel des neurones sensoriels nociceptifs 4. TrkA est fortement exprimé dans les neurones nociceptifs au cours du développement précoce et la médiation de la survie des neurones dépendant du NGF, la croissance des axones, arborisation cible innervation et 9.5. Chez les souris TrkA taulacZ, le gène de type sauvage TrkA est remplacé par une expression de c taulacZassette 10, de telle sorte que la morphologie axonale des neurones positifs putatifs TrkA peut être visualisée par β-gal (X-gal) 11 coloration. Utilisation d'une ligne TrkA taulacZ / WT hétérozygote, nous pouvons examiner les facteurs qui peuvent réglementer ou interférer avec le développement de projections sensorielles afférentes in vivo.
En outre, l'expression TrkA est absent chez les souris homozygotes TrkA taulacZ / taulacZ, qui peuvent donc être utilisés pour évaluer la croissance de l'axone promouvoir des mécanismes en l'absence de signalisation du NGF / TrkA. Etant donné que les neurones nociceptifs dépendent de NGF / TrkA signalisation non seulement pour la croissance des axones, mais aussi pour la survie, on emploie une autre lignée de souris, dépourvu du gène Bax pro-apoptotique, pour inhiber l'apoptose dans les neurones de DRG embryonnaires, les sauver de la mort cellulaire qui est par ailleurs observé en l'absence de signalisation TrkA. Le Bax – / – fond 12 permet ainsi pour la molécudissection lar des voies qui affectent spécifiquement 7-9,13-15 de croissance axone signalisation. Dans TrkA – / -: – Bax / – souris, les neurones DRG survivre, mais sensorielle innervation afférente dans la peau est complètement abolies 14,15. Nous pouvons activer sélectivement les voies de signalisation pour déterminer leurs contributions respectives à l'élaboration de projections axonales. L'utilité de cette méthode est qu'elle permet à l'évaluation des changements de phénotypes de croissance axonale lorsque différentes modifications génétiques sont élevés sur le TrkA taulacZ / taulacZ: Bax – / – ou TrkA taulacZ / WT: Bax – / – milieux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le X-gal procédure de souris embryonnaires TrkA taulacZ coloration décrite ci-dessus permet la visualisation rapide et détaillée des projections axonales longue distance dans l'embryon fixe intacte. En raison de la Bax fond nul ces souris permettent de sonder des mécanismes qui peuvent contribuer à la croissance de l'axone et la survie neuronale de signalisation. Accouplement avec transgéniques ou knock-out souris d'intérêt permet une évaluation globale des phénotypes …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Louis Reichardt pour les souris TrkA taulacZ et Dr. Annette Markus pour la discussion et suggestions perspicaces. Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage de la Fondation Burke ainsi que la Fondation Whitehall subvention de recherche 2010-08-61, une subvention de la Fondation Wings de vie (WFL-US-028/14) pour la recherche, accorder ZB1-1102-1 de la Christopher et Dana Reeve Foundation, et les subventions et 1R01EY022409 3R01EY022409-01S1 du National Eye Institute, à JZ. KJO est un compagnon de Goldsmith.
Materials
| Company | Catalog Number | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 |
| PBS | Life Tech | 10010-023 |
| Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B |
| Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B |
| Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 |
| Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 |
| Incubator | Labline | Model 120 |
| Insect pins | FST | 26000-30 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 |
| 6 well dish | USA Scientific | CC7672-7506 |
| Primers | IDT | custom DNA primers |
| Takara dNTP mixture | Takara | 4030 |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A |
| PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 |
| Dissecting microscope | Leica | M205A |
| Camera | Leica | DFC310FX |
| Ring light | Leica | MEB110 |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
Referencias
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