كله جبل التصوير من جنين فأر التوقعات الحسية أكسون
Summary
We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.
Abstract
تصور كامل طول التوقعات العصبية في الأجنة أمر ضروري للحصول على فهم كيفية تطور الثدييات الشبكات العصبية. نحن هنا تصف طريقة لتسمية في الموقع مجموعة فرعية من عقدة الجذر الظهري (DRG) التوقعات محور عصبي لتقييم خصائصها المظهرية باستخدام عدة خطوط الماوس التلاعب بها وراثيا. الخلايا العصبية-TrkA الإيجابية هي الخلايا العصبية مستقبلة الأذية، مخصصة لنقل إشارات الألم. نحن نستخدم خط الماوس TrkA taulacZ لتسمية مسارات كافة محاور الطرفية-TrkA إيجابي في جنين الفأر سليمة. نحن أبعد تولد خط TrkA taulacZ على خلفية فارغة باكس، الذي يلغي أساسا موت الخلايا المبرمج العصبية، من أجل تقييم الأسئلة المتعلقة النمو بشكل مستقل عن الآثار المحتملة للالتلاعب الجيني على بقاء الخلايا العصبية. وفي وقت لاحق، هي ولدت الفئران المعدلة وراثيا في المصالح مع TrkA taulACZ / باكس خط باطل ونحن على استعداد لدراسة باستخدام التقنيات الموصوفة هنا ثم. ويشمل هذا العرض معلومات مفصلة عن خطط تربية الماوس، التنميط الجيني في وقت تشريح، وإعداد الأنسجة، وتلطيخ والمقاصة للسماح لرؤية كامل طول مسارات محور عصبي في إعداد كامل جبل.
Introduction
إنشاء شبكات الخلايا العصبية الدقيقة هي عملية التنموية المعقدة ضرورية لوظائف الجهاز العصبي. اضطراب في هذه العملية يؤدي إلى اختلال الوظائف العصبية التي تورطت في الأمراض العصبية الإنسان 1-3. لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء نمو محور عصبي وتعصيب المستهدفة في الثدييات، وقد وضعنا بروتوكولا لتصور مسارات محور عصبي من TrkA، معربا عن الخلايا العصبية الحسية باستخدام مزيج من اثنين من خطوط الماوس المعدلة وراثيا.
TrkA هو مستقبلات لعامل نمو الأعصاب NGF، وهو علامة وظيفية من الخلايا العصبية الحسية مسبب للألم 4. وأعرب عن TrkA غاية في الخلايا العصبية مسبب للألم خلال التنمية في وقت مبكر ويتوسط بقاء الخلايا العصبية التي تعتمد على NGF، والنمو محور عصبي، تشجر والهدف تعصيب 5-9. في الفئران TrkA taulacZ، يتم استبدال البرية نوع الجينات TrkA من قبل taulacZ التعبير جassette 10، على ان يكون التشكل محور عصبي من الخلايا العصبية-TrkA الإيجابية المفترضة يمكن تصور كتبها β-غال (X-غال) تلطيخ 11. باستخدام سطر TrkA taulacZ / WT متخالف، يمكننا دراسة العوامل التي قد تتداخل مع تنظيم أو تطوير التوقعات وارد الحسية في الجسم الحي.
وعلاوة على ذلك، TrkA التعبير غائبة في الفئران متماثلة اللواقح TrkA taulacZ / taulacZ، والتي يمكن بالتالي استخدامها لتقييم نمو محور عصبي تعزيز آليات في غياب NGF / TrkA الإشارات. منذ الخلايا العصبية مسبب للألم تعتمد على NGF / TrkA يشير ليس فقط للنمو محور عصبي، ولكن أيضا من أجل البقاء، ونحن توظيف خط الماوس آخر، تفتقر إلى الجين باكس المؤيد لأفكارك، لمنع موت الخلايا المبرمج في الخلايا العصبية DRG الجنينية، إنقاذهم من موت الخلايا التي هي على خلاف ذلك لوحظ في غياب TrkA الإشارات. وباكس – / – 12 الخلفية مما يسمح للmolecuتشريح لار من مسارات الإشارات التي تؤثر على وجه التحديد 7-9،13-15 نمو محور عصبي. في TrkA – / -: باكس – / – الفئران، والخلايا العصبية DRG البقاء على قيد الحياة، ولكن الحسي تعصيب وارد في الجلد وألغيت تماما 14،15. يمكننا تفعيل انتقائي مسارات إشارات لتحديد مساهماتها في تطوير التوقعات محور عصبي. فائدة هذه الطريقة هي أنها تسمح للتقييم التغيرات في الظواهر نمو محور عصبي عندما تربى تعديلات وراثية مختلفة على TrkA taulacZ / taulacZ: باكس – / – أو TrkA taulacZ / WT: باكس – / – الخلفيات.
Protocol
Representative Results
Discussion
الإجراء المبين أعلاه تلطيخ X-غال من الفئران الجنينية TrkA taulacZ يسمح لتصور سريع ومفصل من التوقعات محور عصبي لمسافات طويلة في الجنين ثابتة على حالها. بسبب الخلفية فارغة باكس هذه الفئران تسمح للتحقق من الإشارات الآليات التي يمكن أن تسهم في نمو كل من محور عص?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور لويس Reichardt للفئران TrkA taulacZ والدكتور أنيت ماركوس للمناقشة والاقتراحات الثاقبة. وأيد هذا العمل من جانب صناديق بدء التشغيل من مؤسسة بيرك وكذلك مؤسسة وايت هول منحة بحثية 2010-08-61، منحة بحثية من أجنحة لمؤسسة الحياة (WFL-US-028/14)، منح ZB1-1102-1 من كريستوفر ودانا ريف مؤسسة، والمنح 1R01EY022409 و3R01EY022409-01S1 من المعهد الوطني للعيون، لJZ. عمليات الخفجي المشتركة هو زميل جولدسميث.
Materials
| Company | Catalog Number | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 |
| PBS | Life Tech | 10010-023 |
| Tissue Rinse Solution A | Millipore | BG-6-B |
| Tissue Rinse Solution B | Millipore | BG-7-B |
| Tissue Stain Base Solution | Millipore | BG-8-C |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 |
| Glass scintiallation vial | Kimble Chase | 74500-20 |
| Incubator | Labline | Model 120 |
| Insect pins | FST | 26000-30 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 |
| 6 well dish | USA Scientific | CC7672-7506 |
| Primers | IDT | custom DNA primers |
| Takara dNTP mixture | Takara | 4030 |
| Takara LA buffer | Takara | RR002A |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A |
| PCR machine | Bio-Rad | DNA Engine Dyad |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | B-1042 |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B-6630 |
| Dissecting microscope | Leica | M205A |
| Camera | Leica | DFC310FX |
| Ring light | Leica | MEB110 |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
Referencias
- Verze, L., et al. Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV. Neurology. 55, 126-128 (2000).
- Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents with complex regional pain syndromes. Pain. 131, 153-161 (2007).
- Uceyler, N., et al. Small fibers in Fabry disease: baseline and follow-up data under enzyme replacement therapy. J Peripher Nerv Syst. 16, 304-314 (2011).
- Reichardt, L. F., Mobley, W. C. Going the distance, or not, with neurotrophin signals. Cell. 118, 141-143 (2004).
- White, F. A., et al. Synchronous onset of NGF and TrkA survival dependence in developing dorsal root ganglia. J Neurosci. 16, 4662-4672 (1996).
- Farinas, I., Wilkinson, G. A., Backus, C., Reichardt, L. F., Patapoutian, A. Characterization of neurotrophin and Trk receptor functions in developing sensory ganglia: direct NT-3 activation of TrkB neurons in vivo. Neuron. 21, 325-334 (1998).
- Markus, A., Zhong, J., Snider, W. D. Raf and akt mediate distinct aspects of sensory axon growth. Neuron. 35, 65-76 (2002).
- Kuruvilla, R., et al. A neurotrophin signaling cascade coordinates sympathetic neuron development through differential control of TrkA trafficking and retrograde signaling. Cell. 118, 243-255 (2004).
- Zhong, J., et al. Raf kinase signaling functions in sensory neuron differentiation and axon growth in vivo. Nature. 10, 598-607 (2007).
- Bulfone, A., et al. An olfactory sensory map develops in the absence of normal projection neurons or GABAergic interneurons. Neuron. 21, 1273-1282 (1998).
- Moqrich, A., et al. Expressing TrkC from the TrkA locus causes a subset of dorsal root ganglia neurons to switch fate. Nature. 7, 812-818 (2004).
- Knudson, C. M., Tung, K. S., Tourtellotte, W. G., Brown, G. A., Korsmeyer, S. J. Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death. Science. 270 (5233), 96-99 (1995).
- Lentz, S. I., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., Snider, W. D. Neurotrophins support the development of diverse sensory axon morphologies. J. Neurosci. 19, 1038-1048 (1999).
- Patel, T. D., Jackman, A., Rice, F. L., Kucera, J., Snider, W. D. Development of sensory neurons in the absence of NGF/TrkA signaling in vivo. Neuron. 25, 345-357 (2000).
- Donovan, K. J., et al. B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS. The Journal of experimental medicine. 211, 801-814 (2014).
- Mercer, K., et al. Expression of endogenous oncogenic V600EB-raf induces proliferation and developmental defects in mice and transformation of primary fibroblasts. Cancer research. 65, 11493-11500 (2005).
- Tronche, F., et al. Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety. Nature genetics. 23, 99-103 (1999).
- Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
- Feng, G., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. DiI-labeling of DRG neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord. J Vis Exp. , (2011).
