We describe a technique for measuring aortic stiffness from its pressure-diameter relationship in vivo in mice. Aortic diameter is recorded by ultrasound and aortic pressure is measured invasively with a solid-state pressure catheter. Blood pressure is changed incrementally and the resulting diameter is measured.
Vi presenterer en protokoll for å måle in vivo aorta stivhet hos mus ved hjelp av høyoppløselige ultralydavbildning. Aorta-diameter målt ved hjelp av ultralyd og aortisk blodtrykk måles invasiv med et faststofftrykk kateter. Blodtrykk forhøyes deretter senkes trinnvis ved intravenøs infusjon av vasoaktive medikamenter fenylefrin og natriumnitroprussid. Aorta-diameter måles for hvert trykktrinn for å karakterisere den trykk diameter forholdet mellom stigende aorta. Stivhet indekser avledet fra forholdet trykk-diameter kan beregnes ut fra de data som samles inn. Beregning av arterieføyelighet er beskrevet i denne protokoll.
Denne teknikken kan brukes til å undersøke mekanismene bak øket aorta stivhet forbundet med kardiovaskulær sykdom og aldring. Teknikken gir en fysiologisk relevant mål på stivhet i forhold til ex vivo tilnærminger fordi physiological påvirkninger på aortic stivhet er innarbeidet i målingen. Den primære begrensning ved denne teknikk er at målefeil innført fra bevegelsen av aorta under hjertesyklusen. Denne bevegelse kan kompenseres ved å justere plasseringen av proben med den aortiske bevegelse så vel som å gjøre flere målinger av aorta trykk-diameter forhold og utvide den eksperimentelle gruppen størrelse.
Økt aortic stivhet er et kjennetegn for kardiovaskulær sykdom. Aldring 1, røyke 2, diabetes 3, hyperlipidemi 4, og andre risikofaktorer for hjerte- og karsykdommer har vist seg å øke aortic stivhet. Epidemiologiske studier har videre vist aorta stivhet som en kraftig uavhengig prediktor for angrep av koronar hjertesykdom og slag, samt forekomsten av kardiovaskulære hendelser og mortalitet 5-8. På grunn av den kliniske og betydning for folkehelsen av økt stivhet aorta, er dagens forskning fokusert på å forstå mekanismene bak utviklingen og progresjonen av vaskulær stivhet. Stor interesse finnes derfor i å utvikle nøyaktige målinger av vaskulær stivhet i eksperimentelle modeller for kardiovaskulær sykdom.
En materialets stivhet kan være preget av sin stress belastning forhold og kvantifisert som elastisk modUlus. En lineær elastisk materiale deformeres reversibelt og dens stresset øker proporsjonalt med belastning. Aorta og de store arterier er lineære elastiske organer: når strukket, ikke stivhet av arterien ikke forbli konstant, men øker med graden av distensjon. Denne ikke-linearitet i de mekaniske egenskaper av store arterier er på grunn av de forskjellige stivhetsegenskapene til de lastbærende elementer, nemlig elastin og kollagen, som utgjør beholderveggen. Elastin er meget utvidbar med en elastisitetsmodul på 0,6 MPa. Til sammenligning er kollagen meget stiv med en elastisitetsmodul på 1 GPa 9. Den opprinnelige stivhet oppvises av aorta ved lavere strekkverdier er knyttet til elastin mens den høye stivhet oppviste ved høye strekkverdier er på grunn av kollagen. Lasten overføres fra elastin til kollagen som fartøyet distends og denne regionen av last overføring er der det vaskulære systemet opererer. Derfor ved fysiologisk press, arteriell stivheter avhengig av bidraget fra både elastin og kollagen 10.
Fordelingen og orienteringen av elastin og kollagen variere fra lag i arterieveggen. I media, er det elastin, kollagen, og glatte muskelceller buntet inn i trange helikser som er lagdelt konsentrisk. Dette arrangement gjør det mulig for arterien for å motstå høye belastninger i omkretsretningen. Adventitia er overveiende kollagen med lite elastin og kollagen fibrene er organisert på en nettlignende måte. Disse kollagenfibre er bølgete i ubelastet tilstand og rette ut som belastningen øker. Stivhet øker etter hvert som kollagen fibrene rette ut, og dermed hindre at arterien overstrekking og sprekker. På grunn av den strukturelle organisering og varierende orientering av kollagenfibre, arterier er anisotrope: stivheten oppviste avhenger av om fartøyet er strukket i lengderetningen eller langs omkretsen 11 In vivo stiffnes.s er derfor en sammensetning av aorta langsgående og omkretsmessig stivhet.
Arteriell stivhet er generelt kvantifiseres in vivo som compliance eller pulsbølgehastighet (PWV). Arterieføyelighet er definert som C = DD / AP hvor DD er forandring i diameter og AP er den tilsvarende forandring i trykk. Lavere verdier av etterlevelse indikere stivere fartøy. Compliance beregnes fra trykk-dimensjonen forholdet av arterien, og er derfor et direkte mål på stivhet. Som stivhet spres ikke jevnt i blodkar 12, bør samsvar måles på samme / lignende plassering i hvert fag for å lage meningsfulle sammenligninger mellom eksperimentelle grupper.
Forskjellen mellom samsvar og elastisitetsmodul er at elastisitetsmodulen er normalisert til materialets dimensjoner. Compliance gjenspeiler derfor strukturell stivhet, mens elastisk modulus reflects materiell stivhet. Med aldring, arteriell veggtykkelsen øker og elastin / kollagen andelen synker, så både strukturell stivhet og materiell stivhet er større.
Sammenlignet med compliance, er PWV et indirekte mål på arteriell stivhet. PWV er den hastighet ved hvilken en trykkpuls beveger seg langs en lengde av arterien og er påvirket av egenskapene til karveggen. Den Moens-Korteweg ligningen brukes til å modellere forholdet mellom PWV og elastisitetsmodul: PWV 2 = E h / (2 ρ r), hvor E er trinnvis elastisitetsmodul, h er veggtykkelsen, er ρ blod viskositet, og r er radius fartøyet . En høyere PWV verdi foreslår derfor en stivere fartøy.
Compliance og elastisitetsmodul kan måles eksperimentelt ex vivo på en utskåret del av fartøyet. Å bestemme compliance er segment fartøyet montert på en trykk myograph 13,14. Trykket i beholderen økes trinnvis og the forandring i diameter spores ved hjelp av videomikroskopi. I overensstemmelse bestemmes fra trykk diameter data. Inkrementell elastisitetsmodul kan måles ved strekkprøving. I disse eksperimentene blir beholderen trekkes fra hverandre trinnvis og kraft-forskyvningsdata er oppsamlet inntil fartøyet ring pauser. Stress og belastning verdier kan beregnes og plottes å bestemme inkrementell elastisk modulus. Disse ex vivo-metoder kan anvendes for å evaluere endringer i de passive egenskaper som påvirker stivhet.
In vivo, i tillegg vegg innhold, er vaskulær stivhet påvirket dynamisk av glatt muskel tone og blodtrykk 13,15,16. PWV er den mest brukte metoden for å måle in vivo aorta stivhet i eksperimentelle modeller. PWV kan bestemmes invasivt ved hjelp av Doppler ultralyd eller applanation tonometri 17. Trykkpuls blir målt ved to adskilte steder, og den tid som kreves forpulsen å traversere avstanden er pulsbølgehastighet. Fordi PWV blir målt over en lengde på aorta, er det en gjennomsnittlig verdi av stivhet. Store arterier er ikke-lineær elastisk, slik stivhet og derfor PWV vil variere med blodtrykk. En høyere PWV verdien kan derfor oppstå fra økt stivhet eller forhøyet trykk. PWV verdier derfor må være normalisert til blodtrykket til å utlede konklusjoner om fartøyets stivhet. Målemetoder som inkluderer påvirkning av blodtrykket med de passive egenskapene til vaskulær vegg og effekter av vasoaktive mediatorer som endrer tone ville gi en fysiologisk relevant indeks for arteriell stivhet. Denne fremgangsmåten gjennomføres ved å måle PWV invasiv ved hjelp av et kateter med to trykksensorer adskilt i en fast avstand 13. Denne dual press kateter settes inn i aorta og vasoaktive medikamenter, for eksempel fenylefrin eller natriumnitroprussid, blir tilført intravenøst gjennomet venekateter for å heve og senke blodtrykk.
Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for å bestemme aorta stivhet in vivo fra sin press-dimensjonsforhold i en musemodell. Denne tilnærmingen gir flere fordeler fremfor invasiv PWV måling. Stivhet indekser, slik som overensstemmelse, kan beregnes ut fra den trykkdimensjonsdata som er samlet ved denne fremgangsmåte. Videre tillater denne teknikken for måling av lokal aortic stivhet fordi stivhet måles fra ett sted. Denne fremgangsmåten er spesielt nyttig i å måle stigende aorta-stivhet som den korte lengden av dette området gjør en PWV måling vanskelig å oppnå. Forskningsinteresse finnes spesielt i stigende aorta fordi dens mekaniske egenskaper påvirker blodgjennomstrømming i koronar sirkulasjon og hjerte respons på vaskulær dysfunksjon.
Å måle trykket diameter forholdet av aorta in vivo </em>, er den oppadstigende aorta visualisert og dens diameter er målt ved ultralydavbildning. Aorta-blodtrykket måles invasiv med en trykk kateter. Blodtrykket endres trinnvis ved intravenøs infusjon av vasoaktive medikamenter. Fenylefrin innsnevrer blodårer, og brukes til å heve aortisk trykk. Natriumnitroprussid utvider blodkar, og blir brukt til å senke aortisk trykk. Systolisk og diastolisk aorta diameter og tilsvarende aorta trykk måles for hver trykkøkning. Compliance kan beregnes fra trykket diameter innsamlede dataene.
Inntak av diametermålinger ved flere trykk inkrementer over et vidt område av trykkverdier som er nødvendig for nøyaktig karakterisering av forholdet trykk-diameter. De øvre og nedre trykkgrenser som kan induseres farmakologisk kan variere fra den eksperimentelle gruppe, men det ideelle området er omkring 25 mm Hg til 125 mm Hg diastolisk og 50 mm Hg til 200 mm Hg systolisk. Doser på 360 mikrogram / kg / min PE og 240 mikrogram / kg / min SNP generelt framprovosere grensene for trykkområdet. Imidlertid kan doser av PE økes til 480 ug / kg / min, og SNP til 360 ug / kg / min for å verifisere at de grenser er nådd. Arbeider konsentrasjoner av PE og SNP kan reduseres for å oppnå finere trykk trinn. Ettersom diameteren vil endres med aortisk trykk, indusere de samme trykkverdier mellom dyr og forsøksgrupper er ikke viktig.
Venøse og arterielle kanylering kan utføres på andre steder med samme outcomes. Halevenen kanylering kan være utfordrende på grunn av den lille størrelsen av halevenen. Videre er halevenen ikke er lett synlig i mørke mus. Lårvenen kan kanylert som et alternativ. Denne ruten kan være enklere siden lårvenen er mer tilgjengelig. For trykkkateterinnførings, foruten lårarterien, kateteret kan innføres gjennom carotis. Lårarterien er å foretrekke over halspulsåren, men fordi bryst region forblir intakt for ultralydavbildning. Lårarterie kanylering kan være mer vanskelig på grunn lårarterien er mindre. Ved anvendelse av en 1.2 F kateteret og innføring av kateteret i den proksimale lårarterien under bukhulen vil lette kanylering prosessen. Plassere noen få dråper av et vasodilaterende middel som lidokain på lårarterien eller ved hjelp av et kateter innførings kan også bidra til større fartøyet for å lette innsetting av kateteret. Trykket kateteret skal håndteres og brukeshenhold til produsentens instruksjoner.
Plassering av kateteret i aorta trenger ikke å være konsistent mellom dyr som trykkfallet i aorta er ubetydelig. Imidlertid, å plassere kateteret på den abdominale aorta kan være bedre å minimalisere interferens med ultralydavbildning av torakal aorta. Enkelte ultralydstormaskiner kan ta opp trykket i sanntid med M-modus spor, og dermed gi en trykkmåling for hver diameter målt på M-modus. Dessverre, fordi det sted hvor diameteren måles ikke på samme sted som hvor trykket blir registrert, finnes et etterslep mellom trykket registreres på kateteret og det faktiske trykk i den oppadstigende aorta. Som et resultat av dette kan bare maksimum og minimum diameter målingene brukes for dataanalyse.
Den primære begrensning ved denne metode er den usikkerhet i måle introdusert av aorta skiftende inn og ut of ultralyd plan under hjertesyklusen. Motion-introdusert feil er felles for alle bildebaserte studier, inkludert MR og CT. Kompensasjonsstrategier inkluderer bruk av anatomiske trekk å skifte referanseramme med bevegelse 18 og er gjennomført i løpet av databehandling. Som bevegelseskompensasjon programvare er ikke lett tilgjengelig, har etterforskeren å være årvåken om å justere plasseringen av sonden å spore skifte i plasseringen av aorta som blodtrykket stiger og synker. Diametermålinger bør også tas gjennom sentrum av aorta. Imidlertid, å bestemme hvorvidt den M-modus-opptak plassering passerer gjennom sentrum kan være vanskelig å bedømme på ultralydbildet, spesielt med aorta skiftende stillinger. Usikkerheten introdusert av disse begrensningene manifest i graden av spredning i dataene, slik det fremgår i figur 6. Innhenting av et bilde av tverrsnittet i stedet for lengdeaksen av Ascending aorta kan være en løsning. Men å skaffe dette synet kan noen ganger være mer utfordrende og den resulterende M-modus spor kan være mindre klar. Tverrsnittsomkrets fra B-modus bilde kunne måles i stedet for diameteren fra M-modus bilde. Imidlertid, å bestemme når maksimal og minimal omkrets har blitt oppnådd, vil være begrenset av B-modus bildefrekvens og kan være mer vanskelig å bedømme enn på M-modus.
Å gjøre flere målinger av trykk diameter tomten og økende eksperimentelle gruppestørrelse kan forbedre nøyaktigheten av dataene. De trykk-diameter-data kan samles inn fra flere steder langs brystet. Denne protokollen vil først utføres med sonden plasseres på et sted på brystet. Aorta vil da bli visualisert med proben plasseres på et annet sted og protokollen gjentatt.
Vasoaktive midler som brukes til å modulere blodtrykk kan potensielt påvirke aortic glatt muscle tone, som i sin tur vil påvirke stivheten. Imidlertid har manipulering av aorta trykk ved venøse retur vist seg å gi tilsvarende forandringer i invasiv målt PWV som farmakologisk manipulasjon i rotter. Disse funnene viser at infusjon av vasoaktive medikamenter virker primært på de perifere motstand arterier og ikke vesentlig påvirke aortic glatt muskel tone 19.
Denne protokollen kan bli utført på rotter med noen mindre modifikasjoner. Brystet er barbert før påføring Hårfjerningskrem. En kommersielt tilgjengelig 27 G x ½ "kateter anvendes for medikamentinfusjon. Den medikamentdoser som brukes til å modulere aorta trykket er 40, 80 og 120 ug / kg / min av PE og 40, 80 og 120 ug / kg / min av SNP.
Foruten den stigende aorta, kan regionale forskjeller i aortic stivhet bestemmes med denne protokollen. Regional stivhet målt ved denne tilnærmingen ville være mer presis enn ved PWV som målinger are tatt fra ett sted som motsetter seg til to steder for PWV. Imidlertid er områdene langs aorta som kan måles med denne teknikken er begrenset til de som kan bli visualisert ved hjelp av ultralyd.
Elastisitetsmodul kan også beregnes ut fra de data som er samlet ved denne metode hvis en veggtykkelsesmåling kan oppnås. Nøyaktig måling av in vivo muse aorta er begrenset av oppløsnings grensene for dagens ultralyd-teknologi. Tidig forbedring av ultralydteknologi kan gjøre in vivo veggtykkelse måling mer gjennomførbart. Som et alternativ, kan tykkelsesmålinger utføres ex vivo. Trykk myography ville gi de mest nøyaktige målingene fordi tykkelsen kan måles ved hvert trykk tilvekst.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a National Heart, Lung, and Blood Institute grant 1RO1-HL-105296-01 (to D.E. Berkowitz) and an Australian Research Council Grant DP110101134 (to A. Avolio).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Equipment | |||
High-resolution ultrasound machine | Visual Sonics | Vevo2100 | |
13-24 MHz transducer | Visual Sonics | MS250 | Used for imaging rats |
22-55 MHz transducer | Visual Sonics | MS550D | Used for imaging mice |
Imaging Station | Visual Sonics | Imagine Station 1 | |
1.2F Pressure catheter | Transonic | FTH-1211B-0018 | |
SP200 pressure control unit | Transonic | FFS-095-DP01 | |
Standard Infusion Only Harvard Pump 11 Plus syringe pump | Harvard Apparatus | 702208 | |
Isoflurane vaporizer | VetEquip | 911103 | |
Induction chamber | VetEquip | 941443 | |
100% O2 | Airgas | OX USP200 | |
Single Stage Brass 0-50 psi General Purpose Cylinder Regulator CGA540 | Airgas | Y11215B540 | |
Stereo Boom Stand Microscope | National Optical | 420-BMSQ | |
Fiber optic illuminator & light pipe | Cole Palmer | EW-41500-50 | |
Supplies | |||
30G x 1/2" BD PrecisionGlide Needle | BD | 305106 | For tail vein cannulation in mice |
Polyethylene Tubing PE10 | Becton Dickinson | 427401 | For tail vein cannulation in mice |
27Gx1/2" Surfloe winged infusion set | Terumo | SV*27EL | For tail vein cannulation in rats |
Signa Gel Electrode Gel | Parker | 15-25 | Use for ECG recording |
Aquasonic Clear Ultrasound Gel | Parker | 03-08 | Use for ultrasound |
1mL Sub-Q Syringes, 26G x 5/8" | BD | 309597 | |
Nair | Nair | Depilatory cream | |
Histoacryl | TissueSeal | TS1050071FP | Tissue glue |
Braided Silk Suture 6-0 | Teleflex | 104-S | |
Dumostar P55 fine forceps | Roboz | RS-4984 | |
Microscissors | WPI | 501839 | |
Fine scissors | FST | 14060-11 | |
Medium forceps | Ted Pella | 5665 | |
Hemostatic forceps | Roboz | RS-7131 | |
Non-sterile cotton gauze sponge | Fisherbrand | 22-362-178 | |
Cotton tipped applicators | Oritan | 803-WC | |
Label tape | Fisherbrand | 15-901-20 | |
Drugs | |||
Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
R-Phenylephrine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6126 | |
Sodium nitroprusside dihydrate | Sigma Aldrich | 71778 | |
Software | |||
Prism | GraphPad | ||
Excel | Microsoft |