We describe a technique for measuring aortic stiffness from its pressure-diameter relationship in vivo in mice. Aortic diameter is recorded by ultrasound and aortic pressure is measured invasively with a solid-state pressure catheter. Blood pressure is changed incrementally and the resulting diameter is measured.
Se presenta un protocolo para la medición de la rigidez aórtica vivo en ratones utilizando imágenes de ultrasonido de alta resolución. Diámetro de la aorta se mide mediante ecografía y la presión arterial de la aorta se mide invasiva con un catéter de presión de estado sólido. La presión arterial se eleva luego disminuye de forma gradual por infusión intravenosa de fármacos vasoactivos fenilefrina y nitroprusiato de sodio. Diámetro de la aorta se mide para cada etapa de presión para caracterizar la relación presión-diámetro de la aorta ascendente. Índices de rigidez derivados de la relación presión-diámetro se pueden calcular a partir de los datos recogidos. Cálculo de la distensibilidad arterial se describe en este protocolo.
Esta técnica se puede utilizar para investigar los mecanismos subyacentes aumento de la rigidez aórtica asociada con la enfermedad cardiovascular y el envejecimiento. La técnica produce una medida fisiológicamente relevante de la rigidez en comparación con los enfoques ex vivo porque physiological influencias sobre la rigidez aórtica se incorporan en la medición. La principal limitación de esta técnica es el error de medición introducido desde el movimiento de la aorta durante el ciclo cardiaco. Este movimiento puede ser compensada mediante el ajuste de la ubicación de la sonda con el movimiento de la aorta, así como hacer múltiples mediciones de la relación presión-diámetro de la aorta y la ampliación del tamaño experimental grupo.
El aumento de la rigidez aórtica es una característica de la enfermedad cardiovascular. Envejecimiento 1, 2 fumar, la diabetes 3, hiperlipidemia 4, y se ha demostrado que otros factores de riesgo de enfermedad cardiovascular para aumentar la rigidez aórtica. Los estudios epidemiológicos han demostrado aún más la rigidez aórtica como un potente predictor independiente de la aparición de la enfermedad coronaria y accidente cerebrovascular, así como la ocurrencia de eventos cardiovasculares y la mortalidad 5-8. Debido a la importancia clínica y de salud pública de mayor rigidez aórtica, la investigación actual se centra en la comprensión de los mecanismos subyacentes al desarrollo y la progresión de la rigidez vascular. Gran interés por lo tanto existe en el desarrollo de medidas precisas de la rigidez vascular en modelos experimentales de la enfermedad cardiovascular.
La rigidez de un material se puede caracterizar por su relación tensión-deformación y se cuantifica como mod elásticaulus. Un material elástico lineal se deforma de manera reversible y su tensión aumenta de forma proporcional a la tensión. La aorta y las arterias grandes son cuerpos elásticos no lineales: cuando se estira, la rigidez de la arteria no permanece constante, sino que aumenta con el grado de distensión. Esta no linealidad en las propiedades mecánicas de las grandes arterias es debido a las diferentes propiedades de rigidez de los elementos de soporte de carga, a saber, la elastina y colágeno, que constituyen la pared del vaso. La elastina es altamente extensible con un módulo elástico de 0,6 MPa. En comparación, el colágeno es muy rígida con un módulo elástico de 1 GPa 9. La rigidez inicial exhibido por la aorta en valores de tensión inferiores se atribuye a la elastina mientras que la alta rigidez expuesto en altos valores de tensión se debe a colágeno. La carga se transfiere de elastina al colágeno como el recipiente de distiende y esta región de transferencia de carga es donde opera el sistema vascular. Por lo tanto, a presiones fisiológicas, la rigidez arterialdepende de la contribución de la elastina y el colágeno 10.
La distribución y orientación de la elastina y el colágeno varían por capa dentro de la pared arterial. En los medios de comunicación, la elastina, colágeno y células musculares lisas están agrupados en hélices apretados que están en capas concéntricas. Esta disposición permite la arteria para resistir altas cargas en la dirección circunferencial. La adventicia es predominantemente colágeno con poca elastina y las fibras de colágeno se organizan de una manera similar a una red. Estas fibras de colágeno son onduladas en un estado sin tensión y se enderezan a medida que aumenta la carga. Aumenta la rigidez como las fibras de colágeno se enderezan, impidiendo de este modo que la arteria sobre estiramiento y ruptura. Debido a la organización estructural y variando la orientación de las fibras de colágeno, las arterias son anisotrópicas: la rigidez exhibido depende de si el recipiente se estira longitudinalmente o circunferencialmente 11 in vivo stiffnes.Por lo tanto, s es un compuesto de rigidez longitudinal y circunferencial de la aorta.
La rigidez arterial generalmente se cuantifica en vivo como la velocidad de onda de cumplimiento o de pulso (VOP). La distensibilidad arterial se define como C = Dd /? P donde Dd es el cambio de diámetro y? P es el cambio correspondiente en la presión. Los valores más bajos de cumplimiento indican vasos rígidos. El cumplimiento se calcula a partir de la relación presión-dimensión de la arteria y por lo tanto es una medida directa de la rigidez. Como rigidez se difunde no uniforme en la vasculatura 12, su cumplimiento debe medirse en la misma ubicación similar / en cada materia para hacer comparaciones significativas entre los grupos experimentales.
La diferencia entre el cumplimiento y el módulo elástico es que el módulo elástico se normaliza a las dimensiones del material. Por lo tanto, de cumplimiento refleja la rigidez estructural, mientras elástica ref módulolectos rigidez del material. Con el envejecimiento, los aumentos de espesor de la pared arterial y la elastina / relación colágeno disminuye, por lo tanto la rigidez estructural y la rigidez del material son mayores.
En comparación con el cumplimiento, la VOP es una medida indirecta de la rigidez arterial. VOP es la velocidad a la que un impulso de presión viaja a lo largo de una longitud de arteria y está influenciada por las propiedades de la pared del vaso. La ecuación de Moens-Korteweg se utiliza para modelar la relación entre la VOP y el módulo elástico: VOP 2 h = E / (2 ρ r), donde E es el módulo elástico incrementales, h es el espesor de pared, ρ es la viscosidad de la sangre, y r es el radio del vaso . Por tanto, un valor de VOP mayor sugiere un recipiente más rígido.
Cumplimiento y el módulo elástico se pueden medir experimentalmente ex vivo en un segmento escindido de buque. Para determinar el cumplimiento, el segmento de vaso se monta en un myograph presión de 13,14. Presión dentro del recipiente se aumenta por etapas y THe resultante cambio en el diámetro es rastreada mediante microscopía de vídeo. El cumplimiento se determina a partir de los datos de presión de diámetro. Módulo elástico incremental puede ser medido por el ensayo de tracción. En estos experimentos, el recipiente se separan de datos paso a paso y la fuerza-desplazamiento se recoge hasta que el anillo se rompe buque. Los valores de tensión y deformación pueden ser calculados y graficados para determinar el módulo elástico incrementales. Estos enfoques ex vivo se pueden utilizar para evaluar los cambios en las propiedades pasivas que influyen en la rigidez.
In vivo, además de la pared contenido, la rigidez vascular está influenciada de forma dinámica por el tono del músculo liso y 13,15,16 presión arterial. VOP es el método más utilizado para medir la rigidez aórtica vivo en modelos experimentales. VOP se puede determinar de forma no invasiva mediante ecografía Doppler o la tonometría de aplanación 17. Pulso de presión se mide en dos lugares separados y el tiempo requerido parael pulso para atravesar la distancia es la velocidad de onda de pulso. Debido a la VOP se mide en una longitud de aorta, que es un valor promediado de la rigidez. Arterias grandes son no lineal elástico, por lo que la rigidez y por lo tanto la VOP variará con la presión arterial. Por tanto, un valor VOP superior podría surgir de una mayor rigidez o presión elevada. Valores de VOP, por tanto, deben normalizarse a la presión de la sangre para derivar conclusiones acerca de la rigidez del buque. Los métodos de medición que incorporan la influencia de la presión arterial con las propiedades pasivas de la pared vascular y los efectos de mediadores vasoactivos que alteran el tono produciría un índice fisiológicamente relevante de la rigidez arterial. Este enfoque se implementa mediante la medición de la VOP invasiva usando un catéter con dos sensores de presión separados a una distancia fija 13. Este catéter de presión dual se inserta en las drogas aorta y vasoactivos, como la fenilefrina o nitroprusiato de sodio, se infunden vía intravenosa a travésun catéter venoso para recaudar y la presión arterial baja.
Este protocolo describe un método para determinar la rigidez aórtica in vivo a partir de su relación presión-dimensión en un modelo de ratón. Este enfoque ofrece varias ventajas sobre la medición VOP invasiva. Índices de rigidez, tales como el cumplimiento, se pueden calcular a partir de los datos de presión-dimensión recogidos por este procedimiento. Además, esta técnica permite la medición de la rigidez aórtica local debido a la rigidez se mide desde una única ubicación. Este enfoque es particularmente útil en la medición de la rigidez de la aorta ascendente como la corta longitud de esta región hace una medición VOP difícil de obtener. La investigación de interés existe específicamente en la aorta ascendente debido a que sus propiedades mecánicas influyen en la perfusión de la circulación coronaria y la respuesta cardiaca a la disfunción vascular.
Para medir la relación presión-diámetro de la aorta en vivo </em>, la aorta ascendente se visualiza y su diámetro se mide por imágenes de ultrasonido. La presión arterial aórtica se mide invasiva con un catéter de presión. La presión arterial se cambia incrementalmente por infusión intravenosa de fármacos vasoactivos. La fenilefrina contrae los vasos sanguíneos y se utiliza para aumentar la presión aórtica. El nitroprusiato de sodio dilata los vasos sanguíneos y se utiliza para reducir la presión aórtica. Diámetros aórticos sistólica y diastólica y la presión aórtica correspondientes se miden por cada incremento de presión. El cumplimiento se puede calcular a partir de los datos de presión de diámetro recogidos.
Tomando medidas del diámetro en varios incrementos de presión en un amplio rango de valores de presión es necesaria para la caracterización precisa de la relación presión-diámetro. Los límites de presión superior e inferior que pueden ser inducidos farmacológicamente pueden variar según el grupo experimental, pero el rango ideal es de alrededor de 25 mm Hg a 125 mm Hg y diastólica de 50 mm Hg a 200 mm Hg sistólica. Las dosis de 360 mg / kg / min PE y 240 mg / kg / min SNP generalmente suscitar los límites de la gama de presión. Sin embargo, las dosis de PE se puede aumentar a 480 mg / kg / min y SNP a 360 mg / kg / min para comprobar que se han alcanzado los límites. Concentraciones de trabajo de PE y SNP pueden disminuirse para lograr incrementos de presión más finos. Como el diámetro cambiará con la presión aórtica, la inducción de los mismos valores de presión entre los animales y los grupos experimentales no es importante.
Canulación venosa y arterial se pueden realizar en otros lugares con el mismo outcomes. Canalización de la vena de la cola puede ser un reto debido al pequeño tamaño de la vena de la cola. Además, la vena de la cola no es fácilmente visible en ratones de color oscuro. La vena femoral se puede canuló como una alternativa. Esta ruta puede ser más fácil ya que la vena femoral es más accesible. Para la inserción del catéter de presión, además de la arteria femoral, el catéter puede ser insertado a través de la carótida. La arteria femoral es preferible sobre la arteria carótida, sin embargo, debido a que la región del pecho permanece intacto para la formación de imágenes de ultrasonido. Canulación de la arteria femoral puede ser más difícil debido a la arteria femoral es menor. El uso de un catéter de 1,2 F y la introducción del catéter en la arteria femoral proximal debajo de la cavidad abdominal facilitará el proceso de la canulación. La colocación de unas pocas gotas de un agente vasodilatador como la lidocaína en la arteria femoral o el uso de un introductor de catéter también puede ayudar a agrandar el vaso para facilitar la inserción del catéter. El catéter de presión debe ser manipulado y utilizadode acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ubicación del catéter dentro de la aorta no necesita ser consistente entre los animales como la caída de presión dentro de la aorta es insignificante. Sin embargo, colocar el catéter en la aorta abdominal puede ser mejor para reducir al mínimo la interferencia con la imagen de ultrasonido de la aorta torácica. Algunos mainframes ultrasonido pueden registrar la presión en tiempo real con el trazo en modo M, lo que da una medida de presión para cada diámetro medido en el modo M. Desafortunadamente, debido a la ubicación donde se mide el diámetro no es la misma ubicación que en la que se registró la presión, existe un desfase entre la presión registrada en el catéter y la presión real en la aorta ascendente. Como resultado, sólo máximo y mediciones de diámetro mínimo se pueden utilizar para el análisis de datos.
La principal limitación de este método es la incertidumbre en la medición introducido por la aorta desplazamiento dentro y fuera of el plano de ultrasonido durante el ciclo cardiaco. Error de movimiento introducido es común a todos los estudios de imagen basado, incluyendo MRI y CT. Estrategias de compensación incluyen el uso de características anatómicas para cambiar el marco de referencia con el movimiento 18 y se aplican durante el procesamiento de datos. Como software de compensación de movimiento no está fácilmente disponible, el investigador tiene que estar alerta sobre el ajuste de la ubicación de la sonda para rastrear el cambio de ubicación de la aorta a medida que aumenta la presión arterial y disminuye. Las mediciones del diámetro también se deben tomar a través del centro de la aorta. Sin embargo, la determinación de si la ubicación de grabación en modo M se pasa por el centro puede ser difícil juzgar en la imagen de ultrasonido, especialmente con las posiciones aorta cambiantes. La incertidumbre introducida por estas limitaciones se manifiestan en el grado de dispersión en los datos, como es evidente en la Figura 6. La obtención de una imagen de la sección transversal en lugar de eje longitudinal de la Ascending aorta podría ser una solución. Sin embargo, la obtención de este punto de vista puede ser a veces más difícil y el trazo en modo M resultante puede ser menos clara. La circunferencia de la sección transversal de la imagen en modo B se podría medir en lugar de el diámetro de la imagen en modo M. Sin embargo, la determinación de cuándo circunferencia máxima y mínima se ha alcanzado estará limitado por la velocidad de fotogramas de modo B y puede ser más difícil de juzgar que en el modo M.
Cómo hacer varias mediciones de la gráfica de presión-diámetro y el aumento del tamaño del grupo experimental puede mejorar la exactitud de los datos. Los datos de presión-diámetro pueden ser recogidos desde varios lugares a lo largo del pecho. Este protocolo primero se llevaría a cabo con la sonda colocada en un lugar en el pecho. La aorta entonces se visualizó con la sonda colocada en otra ubicación y el protocolo repetido.
Agentes vasoactivos utilizados para modular la presión arterial podrían potencialmente afectar musc liso aórticotono le, que a su vez afectaría a la rigidez. Sin embargo, la manipulación de la presión aórtica por el retorno venoso se ha demostrado para producir cambios similares en la VOP medida invasiva como la manipulación farmacológica en ratas. Estos hallazgos demuestran que la infusión de fármacos vasoactivos actúan principalmente sobre las arterias de resistencia periféricos y no afectan significativamente tono del músculo liso de la aorta 19.
Este protocolo se puede realizar en ratas con algunas modificaciones menores. El pecho se afeita antes de aplicar la crema depilatoria. A comercialmente disponible 27 G x ½ "catéter se utiliza para la infusión del fármaco. Las dosis de los fármacos utilizados para modular la presión aórtica son 40, 80, y 120 mg / kg / min de PE y 40, 80, y 120 mg / kg / min de SNP.
Además de la aorta ascendente, las diferencias regionales en la rigidez aórtica se pueden determinar con este protocolo. Rigidez regional medido por este enfoque sería más preciso que por la VOP como las mediciones are tomado de un lugar como se oponen a dos ubicaciones para la VOP. Sin embargo, las regiones a lo largo de la aorta que se pueden medir con esta técnica se limitan a los que puede ser visualizado por ultrasonido.
El módulo elástico también puede calcularse a partir de los datos recogidos por este método si una medición de espesor de pared se puede obtener. Accurate es la medición in vivo de la aorta del ratón está limitado por los límites de resolución de la tecnología de ultrasonido actual. Mejoramiento futuro de la tecnología de ultrasonido podría hacer es la medición de espesor de pared vivo más factible. Como alternativa, las mediciones de espesores pueden realizarse ex vivo. Miografía Presión proporcionaría las mediciones más precisas porque espesor puede medirse en cada incremento de presión.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a National Heart, Lung, and Blood Institute grant 1RO1-HL-105296-01 (to D.E. Berkowitz) and an Australian Research Council Grant DP110101134 (to A. Avolio).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Equipment | |||
High-resolution ultrasound machine | Visual Sonics | Vevo2100 | |
13-24 MHz transducer | Visual Sonics | MS250 | Used for imaging rats |
22-55 MHz transducer | Visual Sonics | MS550D | Used for imaging mice |
Imaging Station | Visual Sonics | Imagine Station 1 | |
1.2F Pressure catheter | Transonic | FTH-1211B-0018 | |
SP200 pressure control unit | Transonic | FFS-095-DP01 | |
Standard Infusion Only Harvard Pump 11 Plus syringe pump | Harvard Apparatus | 702208 | |
Isoflurane vaporizer | VetEquip | 911103 | |
Induction chamber | VetEquip | 941443 | |
100% O2 | Airgas | OX USP200 | |
Single Stage Brass 0-50 psi General Purpose Cylinder Regulator CGA540 | Airgas | Y11215B540 | |
Stereo Boom Stand Microscope | National Optical | 420-BMSQ | |
Fiber optic illuminator & light pipe | Cole Palmer | EW-41500-50 | |
Supplies | |||
30G x 1/2" BD PrecisionGlide Needle | BD | 305106 | For tail vein cannulation in mice |
Polyethylene Tubing PE10 | Becton Dickinson | 427401 | For tail vein cannulation in mice |
27Gx1/2" Surfloe winged infusion set | Terumo | SV*27EL | For tail vein cannulation in rats |
Signa Gel Electrode Gel | Parker | 15-25 | Use for ECG recording |
Aquasonic Clear Ultrasound Gel | Parker | 03-08 | Use for ultrasound |
1mL Sub-Q Syringes, 26G x 5/8" | BD | 309597 | |
Nair | Nair | Depilatory cream | |
Histoacryl | TissueSeal | TS1050071FP | Tissue glue |
Braided Silk Suture 6-0 | Teleflex | 104-S | |
Dumostar P55 fine forceps | Roboz | RS-4984 | |
Microscissors | WPI | 501839 | |
Fine scissors | FST | 14060-11 | |
Medium forceps | Ted Pella | 5665 | |
Hemostatic forceps | Roboz | RS-7131 | |
Non-sterile cotton gauze sponge | Fisherbrand | 22-362-178 | |
Cotton tipped applicators | Oritan | 803-WC | |
Label tape | Fisherbrand | 15-901-20 | |
Drugs | |||
Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
R-Phenylephrine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6126 | |
Sodium nitroprusside dihydrate | Sigma Aldrich | 71778 | |
Software | |||
Prism | GraphPad | ||
Excel | Microsoft |