We describe a technique for measuring aortic stiffness from its pressure-diameter relationship in vivo in mice. Aortic diameter is recorded by ultrasound and aortic pressure is measured invasively with a solid-state pressure catheter. Blood pressure is changed incrementally and the resulting diameter is measured.
Vi præsenterer en protokol til måling in vivo aorta stivhed hos mus ved hjælp af høj opløsning ultralydsscanning. Aorta diameter måles ved hjælp af ultralyd og aorta blodtryk måles invasivt med et solid-state trykkateter. Blodtrykket hæves derefter sænkes trinvist ved intravenøs infusion af vasoaktive stoffer phenylephrin og natriumnitroprussid. Aorta diameter måles for hver tryk trin til karakterisering af tryk diameter forholdet opstigende aorta. Stivhed indeks stammer fra tryk-diameter forhold kan beregnes ud fra de indsamlede data. Beregning af arterielle compliance er beskrevet i denne protokol.
Denne teknik kan anvendes til at undersøge mekanismerne bag øget aorta stivhed forbundet med kardiovaskulær sygdom og aldring. Teknikken giver en fysiologisk relevant mål for stivhed i forhold til ex vivo metoder, fordi physiological indflydelse på aorta stivhed er indarbejdet i målingen. Den primære begrænsning ved denne teknik er målefejlen indført fra bevægelsen af aorta under hjertecyklussen. Denne bevægelse kan kompenseres ved at justere placeringen af sonden med aorta bevægelse samt at multiple målinger af aortatryk diameter forholdet og udvide forsøgsgruppen størrelse.
Øget aorta stivhed er kendetegnende for hjertekarsygdomme. Aging 1, rygning 2 diabetes 3, hyperlipidæmi 4 og andre risikofaktorer for hjerte-kar-sygdomme har vist sig at øge aorta stivhed. Epidemiologiske undersøgelser har yderligere demonstreret aorta stivhed som en kraftig uafhængig indikator for påbegyndelsen af koronar hjertesygdom og slagtilfælde, samt forekomsten af kardiovaskulære hændelser og mortalitet 5-8. På grund af den kliniske og betydning for folkesundheden af øget aorta stivhed, er aktuel forskning fokuseret på at forstå de mekanismer, der ligger til grund for udviklingen og progressionen af vaskulær stivhed. Stor interesse eksisterer derfor i at udvikle nøjagtige mål for vaskulær stivhed i forsøgsmodeller af hjertekarsygdomme.
En materiales stivhed kan karakteriseres ved sin stress-strain relation og kvantificeret som elastisk modUlus. En lineær elastisk materiale deformerer reversibelt og dens stress stiger proportionalt med stamme. Aorta og de store arterier er lineære elastiske organer: når den strækkes, er stivheden af arterien ikke forbliver konstant, men stiger med graden af distension. Denne ulinearitet i de mekaniske egenskaber af store arterier skyldes de forskellige stivhed af de bærende elementer, nemlig elastin og collagen, der udgør karvæggen. Elastin er yderst strækbar med et elasticitetsmodul på 0,6 MPa. I sammenligning collagen er meget stiv med et elasticitetsmodul på 1 GPa 9. Den oprindelige stivhed udvist af aorta ved lavere belastningsværdier tilskrives elastin mens høj stivhed udviste ved høje belastningsværdier skyldes collagen. Load overføres fra elastin til collagen som fartøjet distends og denne region af belastning overførsel er, hvor det vaskulære system fungerer. Derfor, ved fysiologiske tryk, arteriel stivhedafhænger af bidrag fra såvel elastin og kollagen 10.
Fordelingen og orienteringen af elastin og kollagen varierer fra lag i arterievæggen. I medierne er det elastin, kollagen og glatte muskelceller samlet i tætte spiraler, der er lagdelt koncentrisk. Dette arrangement tillader arterien til at modstå høje belastninger i den rundtgående retning. Adventitia overvejende kollagen med lidt elastin og kollagen fibre er organiseret i et net-lignende måde. Disse kollagen fibre er bølget i en ubelastet tilstand og ordne som belastningen stiger. Stivhed stiger som kollagenfibrene ordne og derved forhindre arterien fra overstretching og brud. På grund af den organisatoriske struktur og varierende orientering af kollagen fibre, arterier er anisotropisk: stivheden udstillet afhænger af, om fartøjet er strakt langs eller periferisk 11 In vivo stivhed.s er derfor sammensat af aorta langsgående og rundtgående stivhed.
Arteriel stivhed er generelt kvantificeres in vivo som overholdelse eller puls bølge hastighed (PWV). Arterielle compliance er defineret som C = AD / AP hvor AD er ændring i diameter og AP er den tilsvarende ændring i trykket. Lavere værdier for overholdelse indikerer stivere fartøjer. Overholdelse beregnes ud fra tryk-dimension forholdet af arterien og er derfor en direkte måling af stivhed. Som stivhed udbredes ikke ensartet i karrene 12, skal måles overensstemmelse med samme / lignende placering i hvert emne at gøre meningsfulde sammenligninger mellem forsøgsgrupper.
Forskellen mellem overholdelse og elasticitetsmodul er, at elasticitetsmodulet er normaliseret til materialets dimensioner. Overholdelse afspejler derfor konstruktionens stivhed, mens elasticitetsmodul reflects materiale stivhed. Med aldring, arteriel væg tykkelse stiger og elastin / kollagen-forholdet falder, så både konstruktionens stivhed og materiale stivhed er større.
I forhold til overholdelse, PWV er et indirekte mål for arteriel stivhed. PWV er den hastighed, ved hvilken en trykimpuls bevæger sig langs en længde af arterie og påvirkes af egenskaberne af karvæggen. Den Moens-Korteweg ligning bruges til at modellere sammenhængen mellem PWV og elasticitetsmodul: PWV 2 = Eh / (2 ρ R) hvor E er trinvis elasticitetsmodul, h er vægtykkelse, ρ er blodets viskositet, og r er fartøj radius . En højere PWV værdi foreslår derfor en stivere fartøj.
Kan måles eksperimentelt ex vivo Overholdelse og elasticitetsmodul på en udskåret segment af skib. For at bestemme overensstemmelse, er fartøjet segment monteret på et tryk myograf 13,14. Tryk i beholderen øges trinvis og the resulterende ændring i diameter er sporet ved hjælp af video mikroskopi. Overholdelse bestemmes ud fra data for pres diameter. Incremental elasticitetsmodul kan måles ved trækprøvning. I disse eksperimenter fartøjet trukket fra hinanden trinvis og kraft-forskydning indsamles indtil fartøjet ring pauser. Stress og belastning værdier kan beregnes og plottes at bestemme trinvis elasticitetsmodul. Disse ex vivo metoder kan anvendes til at vurdere ændringer i de passive egenskaber, der påvirker stivhed.
In vivo, ud over væg indhold er vaskulær stivhed påvirkes dynamisk af glat muskel-tonus og blodtryk 13,15,16. PWV er den mest udbredte metode til måling in vivo aorta stivhed i eksperimentelle modeller. PWV kan bestemmes ikke-invasivt ved hjælp af Doppler ultralyd eller applanation tonometri 17. Trykimpuls måles på to forskellige steder, og den tid, der kræves forpulsen at gennemløbe afstanden er Pulsbølgehastigheden. Fordi PWV måles over en længde af aorta, er det en gennemsnitlig værdi af stivhed. Store arterier er lineær elastisk, så stivhed og derfor PWV vil variere med arterietryk. En højere PWV værdi kunne derfor opstå øget stivhed eller forhøjet tryk. PWV værdier må derfor normaliseret til blodtrykket til at udlede konklusioner om fartøjets stivhed. Målemetoder der inkorporerer indflydelse af blodtryk med de passive egenskaber af karvæggen og virkningerne af vasoaktive mediatorer, der ændrer tone ville give en fysiologisk relevant indeks for arteriel stivhed. Denne fremgangsmåde gennemføres ved måling af PWV invasivt ved hjælp af et kateter med to trykfølere adskilt i en fast afstand 13. Denne dobbelte tryk kateter er indsat i aorta og vasoaktive lægemidler, såsom phenylephrin eller natriumnitroprussid, infunderes intravenøst gennemet venekateter at hæve og sænke arterietryk.
Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til at bestemme aorta stivhed in vivo fra dens tryk-dimension forhold i en musemodel. Denne fremgangsmåde har flere fordele i forhold invasive PWV måling. Stivhed indeks, såsom overholdelse, kan beregnes ud fra de data, tryk-dimension indsamlet af denne procedure. Desuden denne teknik giver mulighed for måling af lokal aorta stivhed, fordi stivhed måles fra et enkelt sted. Denne fremgangsmåde er særlig anvendelig til at måle opstigende aorta stivhed som den korte længde af denne region gør en PWV måling vanskelig at opnå. Forskning interesse findes specifikt i aorta ascendens fordi dens mekaniske egenskaber påvirke perfusion af koronar cirkulation og hjertets reaktion på vaskulær dysfunktion.
Til måling af tryk-diameter forhold af aorta in vivo </em> er opstigende aorta visualiseret og dets diameter måles ved ultralydsscanning. Aorta blodtryk måles invasivt med et tryk kateter. Blodtrykket ændres trinvist ved intravenøs infusion af vasoaktive stoffer. Phenylephrin bremsende blodkar og anvendes til at hæve aortatryk. Natriumnitroprussid dilaterer blodkar og anvendes til at sænke aortatryk. Systolisk og diastolisk aorta diametre og tilsvarende aorta tryk er målt for hver tryk tilvækst. Compliance kan beregnes ud fra data for pres diameter indsamlet.
Måling diameter på stigninger flere tryk over en bred vifte af trykværdier er nødvendig for nøjagtig karakterisering af tryk-diameter forhold. De øvre og nedre trykgrænser der kan farmakologisk induceres kan variere afhængigt af den eksperimentelle gruppe, men det ideelle interval er omkring 25 mm Hg til 125 mm Hg diastolisk og 50 mm Hg til 200 mm Hg systolisk. Doser på 360 mg / kg / min PE og 240 ug / kg / min SNP generelt fremkalde grænserne for trykområdet. Dog kan doser af PE øges til 480 ug / kg / min og SNP til 360 ug / kg / min for at kontrollere, at grænserne er nået. Arbejde koncentrationer af PE og SNP kan reduceres for at opnå stigninger finere tryk. Som diameteren vil ændre sig med aortatryk, inducere de samme trykværdier mellem dyr og eksperimentelle grupper er ikke vigtig.
Venøse og arterielle kanyle kan udføres på andre steder med samme outcomes. Halevenen kanylering kan være udfordrende på grund af den lille størrelse af halevenen. Desuden halevenen ikke er let synlige i mørke farvede mus. Den femorale vene kan være kanylerede som et alternativ. Denne rute kan være lettere, da den femorale vene er mere tilgængelig. For tryk kateteret, foruden den femorale arterie, kateteret kan indsættes gennem carotis. Den femorale arterie foretrækkes i halspulsåren, men fordi brystregionen forbliver intakt for ultralydsscanning. Femorale arterie kanylering kan være mere vanskeligt, fordi den femorale arterie er mindre. Ved hjælp af en 1,2 F kateteret og indføre kateteret i den proximale femorale arterie under bughulen vil lette kanylering proces. Placere et par dråber af en vasodilaterende middel, såsom lidocain på den femorale arterie eller anvendelse af et kateter introducer kan også hjælpe forstørre fartøj for at lette kateteret. Trykket kateter skal håndteres og anvendesifølge producentens instruktioner.
Placering af kateteret i aorta behøver ikke at være i overensstemmelse mellem dyr trykfaldet i aorta er ubetydeligt. Dog kan placere kateteret i den abdominale aorta være bedre at minimere interferens med ultralydsscanning af thorax aorta. Nogle ultralyd mainframes kan optage tryk realtid med M-type-optagelsen, hvilket giver en trykmåling for hver diameter målt på M-mode. Desværre, fordi det sted, hvor diameteren måles ikke på samme sted som, hvor trykket er registreret, foreligger der en forsinkelse mellem trykket registreres ved kateteret og det aktuelle tryk i aorta ascendens. Som et resultat heraf kan kun maksimum og målinger mindste diameter anvendes til analyse af data.
Den primære begrænsning ved denne metode er den måleusikkerhed indført ved aorta flytte ind og ud of ultralyd fly under hjertecyklussen. Motion-introduceret fejl er fælles for alle billeddiagnostiske baserede undersøgelser, herunder MR og CT. Erstatning strategier omfatter hjælp anatomiske træk at flytte referencerammen med bevægelsen 18 og gennemføres under databehandling. Som bevægelseskompensation software er ikke let tilgængelige, investigator skal være på vagt om at justere placeringen af sonden til at spore skiftet i placering af aorta som blodtryk stiger og falder. Diameter målinger bør også tages gennem midten af aorta. Imidlertid kan det bestemmes, om M-mode optagelse placering passerer gennem centrum være vanskeligt at bedømme ultralydsbilledet, især med aorta skiftende positioner. Usikkerheden indført ved disse begrænsninger åbenbart i graden af spredning i data, som fremgår af figur 6. Opnåelse et billede af tværsnittet i stedet for længdeakse Ascending aorta kunne være en løsning. Men at opnå dette synspunkt kan nogle gange være mere udfordrende, og den resulterende M-type-optagelsen kan være mindre klar. Tværsnitsarealet omkreds fra B-mode billedet kan blive målt i stedet for diameteren fra M-mode image. , Bestemmelse Men når maksimum og minimum omkreds er opnået, vil være begrænset af B-mode frame rate og kan være mere vanskeligt at bedømme end på M-mode.
Tage flere målinger af tryk-diameter plot og voksende forsøgsgruppe størrelse kan forbedre nøjagtigheden af dataene. Kan indsamles data tryk-diameter fra flere steder langs brystet. Denne protokol vil først blive udført med proben placeret på et sted på brystet. Aorta vil derefter blive visualiseret med proben placeret på en anden placering, og protokollen gentages.
Vasoaktive midler, der anvendes til at modulere blodtryk kan potentielt påvirke aorta glat MUSCle tone, hvilket igen vil påvirke stivhed. Manipulation af aorta pres fra venøst tilbageløb har imidlertid vist, at producere tilsvarende ændringer i invasivt målt PWV som farmakologisk manipulation hos rotter. Disse resultater viser, at infusion af vasoaktive stoffer virker primært på de perifere modstand arterier og ikke i væsentligt omfang berøre aorta glat muskeltonus 19.
Denne protokol kan udføres i rotter med et par mindre ændringer. Brystet er barberet før påføring hårfjerningsmiddel. En kommercielt tilgængelig 27 G x ½ "Kateteret anvendes til lægemiddelinfusion. Doserne lægemiddel anvendes til at modulere aortatryk er 40, 80 og 120 ug / kg / min af PE og 40, 80 og 120 ug / kg / min af SNP.
Udover opstigende aorta, kan regionale forskelle i aorta stivhed bestemmes med denne protokol. Regional stivhed målt med denne fremgangsmåde ville være mere præcist end ved PWV som målinger are taget fra et sted som modsætter sig til to placeringer for PWV. Men regioner langs aorta, der kan måles med denne teknik er begrænset til dem, der kan visualiseres ved hjælp af ultralyd.
Elasticitetsmodul kan også beregnes ud fra indsamlet af denne metode, hvis der kan opnås måling en vægtykkelse data. Præcis in vivo måling af musen aorta er begrænset af grænserne for nuværende ultralyd teknologi opløsning. Future forbedring af ultralyd-teknologi kan gøre in vivo vægtykkelse måling mere gennemførlig. Som et alternativ kan tykkelsesmålinger udføres ex vivo. Pressure myography ville give de mest præcise målinger, fordi tykkelsen kan måles ved hvert tryk tilvækst.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a National Heart, Lung, and Blood Institute grant 1RO1-HL-105296-01 (to D.E. Berkowitz) and an Australian Research Council Grant DP110101134 (to A. Avolio).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Equipment | |||
High-resolution ultrasound machine | Visual Sonics | Vevo2100 | |
13-24 MHz transducer | Visual Sonics | MS250 | Used for imaging rats |
22-55 MHz transducer | Visual Sonics | MS550D | Used for imaging mice |
Imaging Station | Visual Sonics | Imagine Station 1 | |
1.2F Pressure catheter | Transonic | FTH-1211B-0018 | |
SP200 pressure control unit | Transonic | FFS-095-DP01 | |
Standard Infusion Only Harvard Pump 11 Plus syringe pump | Harvard Apparatus | 702208 | |
Isoflurane vaporizer | VetEquip | 911103 | |
Induction chamber | VetEquip | 941443 | |
100% O2 | Airgas | OX USP200 | |
Single Stage Brass 0-50 psi General Purpose Cylinder Regulator CGA540 | Airgas | Y11215B540 | |
Stereo Boom Stand Microscope | National Optical | 420-BMSQ | |
Fiber optic illuminator & light pipe | Cole Palmer | EW-41500-50 | |
Supplies | |||
30G x 1/2" BD PrecisionGlide Needle | BD | 305106 | For tail vein cannulation in mice |
Polyethylene Tubing PE10 | Becton Dickinson | 427401 | For tail vein cannulation in mice |
27Gx1/2" Surfloe winged infusion set | Terumo | SV*27EL | For tail vein cannulation in rats |
Signa Gel Electrode Gel | Parker | 15-25 | Use for ECG recording |
Aquasonic Clear Ultrasound Gel | Parker | 03-08 | Use for ultrasound |
1mL Sub-Q Syringes, 26G x 5/8" | BD | 309597 | |
Nair | Nair | Depilatory cream | |
Histoacryl | TissueSeal | TS1050071FP | Tissue glue |
Braided Silk Suture 6-0 | Teleflex | 104-S | |
Dumostar P55 fine forceps | Roboz | RS-4984 | |
Microscissors | WPI | 501839 | |
Fine scissors | FST | 14060-11 | |
Medium forceps | Ted Pella | 5665 | |
Hemostatic forceps | Roboz | RS-7131 | |
Non-sterile cotton gauze sponge | Fisherbrand | 22-362-178 | |
Cotton tipped applicators | Oritan | 803-WC | |
Label tape | Fisherbrand | 15-901-20 | |
Drugs | |||
Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
R-Phenylephrine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6126 | |
Sodium nitroprusside dihydrate | Sigma Aldrich | 71778 | |
Software | |||
Prism | GraphPad | ||
Excel | Microsoft |