Une procédure pour l'implantation d'une chambre pour la colonne vertébrale longitudinale<em> In Vivo</em> Imagerie du cordon spinal de souris

NOTE: Le soin et la manipulation expérimentale de toutes les souris dans le présent document a été approuvé par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université Cornell. 1. Mise en place pour la chirurgie Stériliser tous les outils nécessaires en utilisant un autoclave ou procédures de stérilisation approuvés. Au minimum, inclure un scalpel, ciseaux, ciseaux Vanna, pinces, tournevis de bijoutier, des cotons-tiges, un ensemble de rétracteurs, l'implant (figure 1A) et de son système de livraison (figure 1D, E). Essuyez toutes les surfaces, y compris les boutons de stéréoscope, avec 70% d'éthanol et / ou des désinfectants appropriés. Créer un champ stérile en superposant la stereotax personnalisé (figure 1D) et entourant paillasse avec des draps stériles. Coussin chauffant (de préférence de contre-réaction contrôlée) doit être placé sur le dessus de la stereotax et dans les champs stériles. 2. Préparationde la souris pour la chirurgie Anesthésier une souris de moins de 5% d'isoflurane / oxygène dans une chambre d'induction jusqu'à ce que le rythme respiratoire ralentit à environ 1 respiration / sec. Transfert souris pour une zone de transit hors du champ stérile, en utilisant un cône de nez de continuer l'exposition isoflurane. Réduire l'isoflurane à 2%. Appliquer un collyre pour prévenir le dessèchement de la cornée. Administrer le glycopyrrolate (un médicament anticholinergique) à 0,05 mg / 100 g souris par voie intramusculaire dans les pattes arrière à l'aide de 29 à 30 G 3/10 cc aiguilles et seringues, délivrant environ 50% du volume d'injection par branche. REMARQUE: Glycopyrrolate sert à empêcher l'accumulation de liquide dans les poumons alors que la souris est sous anesthésie. L'aide de tondeuses électriques, de se raser une partie de la face dorsale de la souris, environ 3 cm de long sur 2 cm de large et centrée sur l'arc thoracique. Nettoyez toute couper les cheveux à l'écart de la zone rasée. Administrer les injections suivantes voie sous-cutanée et distale à l'raséepatch à l'aide de 29 à 30 g d'aiguilles et 10.3 seringues cc: 1 ml / 100 g souris glucose à 5% dans une solution saline (pour l'hydratation), 5 mg / kétoprofène kg souris (un AINS pour l'analgésie), 0,2 mg / dexaméthasone kg souris ( un stéroïde anti-inflammatoire pour réduire l'inflammation). En utilisant des cotons-tiges, effectuez trois lavages alternés d'iode et de 70% d'éthanol, en attendant 1 min entre les lavages. Administrer 100 pi de bupivacaïne 0,125% (un bloc de nerf périphérique) en utilisant voie sous-cutanée 29 à 30 g d'aiguilles et 3/10 cc seringue au centre du patch rasé pour réduire la douleur au site d'incision. Transfert souris pour l'stereotax personnalisé (figure 1D), insérer thermomètre rectal, et attendre environ 10 minutes pour bupivicaïne prenne effet. 3. Exposer et nettoyer la Dorsale strates de 3 Adjacent Vertèbre thoracique Utilisation de la lame de scalpel, créer un petit (5 mm ou moins) incision au-dessus des vertèbres d'intérêt (figure 2A). <li> En utilisant soit une pince ou en insérant la pointe de ciseaux chirurgicaux et diffuser les poignées, augmenter la taille de l'ouverture dans la peau par dissection. L'utilisation d'un scalpel ou des ciseaux chirurgicaux, dissocier doucement fascia conjonctif entre la peau et le muscle sous-jacent. Utilisez rétracteurs de retenir la peau, permettant un aussi grand espace de travail que possible (figure 2B). Prenez soin de ne pas augmenter la charge sur la poitrine et ainsi obstruer les voies respiratoires. En utilisant une paire de forceps, la poignée la plus rostrale vertèbre qui sera exposé à travers le muscle sus-jacente. Avec un scalpel, couper le tissu loin de chaque côté du processus de dorsale de toute 3 vertèbres (figure 2c). En utilisant ne importe quelle combinaison d'une lame de scalpel, des cotons-tiges, et / ou un grattoir d'os, retirez tous les tissus recouvrant de la dorsale lames (Figure 2D). Avec des ciseaux chirurgicaux, soigneusement couper les tendons attachés aux vertèbres sur les deux lateraL bords de la colonne vertébrale (figure 2E). Utilisation du scalpel, retirer doucement autant de tissu à partir des bords latéraux de la colonne vertébrale que possible afin de fournir une surface de serrage propre. Débrider délicatement les vertèbres d'un tissu mou restant en utilisant un grattoir osseuse et / ou un coton-tige. Coupez en utilisant ne importe quel tissu incongrue ailleurs ciseaux chirurgicaux (figure 2F). NOTE: Il est essentiel à la fois pour serrage et effectuer la laminectomie dorsale que les vertèbres sont proprement exposée. Un cauterizer peut être utile dans le contrôle de saignement ultérieur. Maj rétracteurs de retenir le tissu entourant la colonne vertébrale, en plus de la peau (figure 2F). Fixez les barres latérales implant pour les dents sur les postes de livraison et les charger dans des supports post-les (comme dans la figure 1E). Fixer le 3 vertèbres en utilisant les barres latérales, en appliquant juste assez de pression pour maintenir Securely (Figure 2G, H). Utilisez une pince pour aider à assurer un serrage au niveau de la 3 vertèbres. Notez que plusieurs tentatives peuvent être nécessaires. Veiller à ce que les barres latérales sont à la fois le niveau et parallèle avant d'effectuer la laminectomie. Nettoyer et sécher soigneusement la surface dorsale des vertèbres serrée en utilisant des cotons-tiges. 4. Effectuer une laminectomie Dorsale Insérez le bout des ciseaux Vannas dans l'espace péridural de la vertèbre serrée médial et serrer les poignées à la légère; si l'os est sec, il convient de se fissurer le long de la longueur de la feuille dorsale. Répétez cette procédure sur le côté opposé pour libérer la lame. Préhension doucement la lame lâche par le processus de dorsale avec une pince, retirez soigneusement tout tissu conjonctif aux extrémités rostrale et caudale de la lame et soulevez-le. Utilisation de 0,9% de solution saline et / ou artificielle liquide céphalo-rachidien (ACSF), se laver soigneusement éloigner toute overlyi de sangng de la moelle épinière. Utilisez des cotons-tiges pour absorber l'excès de liquide. Avec des ciseaux Vannas, couper avec précaution les bords latéraux de l'épine dorsale aux barres latérales de l'implant. Encore une fois, laver et contrôler les saignements en utilisant des cotons-tiges et de solution saline / ACSF. Dans le cas où une partie du périoste a détaché et recouvre la moelle épinière, retirez délicatement ce tissu en utilisant des cotons-tiges et / ou d'un 29 – aiguille 30 G. Prenez soin de ne pas blesser la moelle épinière dans cette partie de la procédure. Ne confondez pas le périoste lâche avec la dure-mère bien emballé. Avec précaution, sceller les bords exposés restants de l'os avec une ou les deux de l'acrylique dentaire et cyanoacrylate (Figure 2I). Faites attention de ne pas laisser les colles de circuler sur la moelle épinière exposée. 5. sceller la chambre Positionner la plaque supérieure avec soin afin que les quatre fentes se alignent avec les quatre trous sur les barres latérales et l'ouverture recouvre le spin exposéeal cordon (figure 1B et 2J). En utilisant le tournevis du joaillier, commencer attentivement la première vis, stabiliser l'arbre du tournevis avec une autre paire de pinces. Ne pas serrer la vis à ce stade, mais insérer de sorte que les premiers filets sont engagés. Répétez ce processus pour les trois autres vis. NOTE: Il est utile d'utiliser le titane ou autres pince non magnétisables pour aider à positionner les vis à ce stade. Avec tous les 4 vis en place, serrez chaque vis alternativement par le même montant en petits incréments jusqu'à vis sont fermement arrimés (Figure 2K). Notez qu'il ne est pas inhabituel pour la plaque supérieure de fléchir au cours de ce processus. Prenez soin de ne pas serrer les vis trop, que la tête de vis peut casser et pression à la baisse excessive de déloger la pince et / ou entraîner des blessures de la moelle épinière. Utilisation d'un élastomère de silicone pour remplir l'espace entre la moelle épinière et la fenêtre en verre. Parce qu'il bichene est pas de produire de l'acide acétique lors du durcissement, utiliser KwikSil marque élastomère et embouts mélangeurs. Appliquer une partie libérale de la silicone à la moelle épinière exposée. Prenez soin de se débarrasser de toute silicone contenant des bulles d'air de la pointe de mélange avant l'application de la moelle épinière. En travaillant rapidement, appuyez doucement à 5 mm # 0 lamelle dans l'encart dans la plaque supérieure. Appliquer suffisamment de pression pour serrer progressivement l'élastomère liquide pour entourer la moelle épinière, mais ne entraînera pas la compression de la moelle épinière (Figure 2L). Réglage de l'heure pour l'élastomère est d'environ 90 secondes, alors assurez-vous que la lamelle est appliquée rapidement. Dans le cas d'une étanchéité échoué, attendre jusqu'à ce que l'élastomère est fixé, retirez-le délicatement de l'implant avec une pince, et répéter 05.04 à 05.05. Couvrir les bords d'élastomère exsudée avec dentaire acrylique / cyanoacrylate et d'adhérer à l'os environnant, autant que possible pour empêcher l'élastomère de se déplacer sur la surface de la moelle épinière. Retirer écarteurs et tirez la peau autour de la bordure de l'implant. Utilisation de cyanoacrylate, d'adhérer à la peau des bords de l'implant (figure 2 M, N). Insérez # 0-80 – 1/4 "set vis dans les ailes de la plaque supérieure (figure 1C et 2 O). Utilisant l'acrylique dentaire, sceller les lacunes dans les fentes de vis de la plaque supérieure (Figure 2P). 6. Soins postopératoires Retirer l'animal de l'anesthésie et le lieu dans une grande cage propre. Se assurer que la cage est suffisamment grand pour que la chambre ne sera pas se accrocher sur tout (tel que le plongeur en forme de V pour une bouteille d'eau et / ou de la nourriture) au cours de la locomotion normale tout au long de la cage. NOTE: Une cage de rat norme est idéal. Placer la cage sur une surface chauffée tandis que l'animal se rétablit. Ne pas retourner la souris vers la compagnie d'autres animaux jusqu'à ce qu'il ait totalement récupéré. Vérifiez Beha animaleVior dans les 1-2 heures après l'opération pour des signes de douleur ou de détresse et de l'intégrité des implants. NOTE: Dans des conditions normales, l'animal doit être capable de déambuler avec des perturbations modestes à la circulation. Continuez à vérifier tous les animaux 8-12 h pour les 72 premières heures, mesurer le poids et le comportement de surveillance. Vérifiez que les animaux sont actifs et mobiles pendant la nuit. Nourriture humide sous la forme de terrain Chow mélangé avec de l'eau ou des gels nutritionnels, des pastilles de chow, et l'eau potable devrait être fournie au niveau du sol. Hydratation supplémentaire par des injections sous-cutanées ou intraperiotoneal devrait être fourni si nécessaire. Administrer 5 mg / kg souris kétoprofène et 0,2 mg / kg de dexaméthasone de la souris sous-cutanée à 24 et 48 points de temps h, après l'opération. En outre, 0,005 à 0,010 mg / 100 g souris doit être administré toutes les 8 h par injection sous-cutanée pendant 72 heures. 7. In Vivo Imaging Anesthésier une souris sous5% d'isoflurane / oxygène dans une chambre d'induction jusqu'à ce que le rythme respiratoire ralentit à environ 1 respiration / sec. Transfert souris pour l'stereotax personnalisé (figure 1D) avec retour contrôlé coussin chauffant et insérez thermomètre rectal. Réduire l'isoflurane à 2%. Administrer glycopyrrolate 0,05 mg / 100 g par voie intramusculaire de la souris dans les membres postérieurs en utilisant de 29 à 30 G 3/10 cc aiguilles et seringues, délivrant environ 50% du volume d'injection par branche. Administrer 1 ml / 100 g souris 5% de glucose (par voie sous-cutanée) hydratation dans une solution saline une fois par heure. Insérez les détenteurs de chambre filetées dans les supports post utilisés pour la chirurgie (figure 1F). Réglez la hauteur et tordre les messages sur les vis de réglage dans la plaque supérieure. Avec les deux supports fixés, élever les titulaires dans des supports post-les jusqu'à ce que la poitrine peut se dilater librement sur l'inspiration. REMARQUE: Tant le ferme attachement des titulaires et la libre expansion de la poitrine significantly réduire les artefacts de mouvement due à la respiration. Effectuer imagerie comme souhaité. Lorsque imagerie est terminée, les messages inférieurs, enlevez détenteurs de chambre, supprimer thermomètre rectal, et le lieu souris sur une surface chauffée pour récupérer. Ne pas retourner la souris vers la compagnie d'autres animaux jusqu'à ce qu'il ait totalement récupéré.