Summary

Isolering af Distinct cellepopulationer fra udviklingslandene lillehjernen ved mikrodissektion

Published: September 21, 2014
doi:

Summary

Nestin-udtrykkende progenitorer er en nyligt identificerede population af neuronale stamceller i det udviklende cerebellum. Ved hjælp af mikrodissektion teknik præsenteres her i kombination med fluorescerende cellesortering, kan denne cellepopulation oprenses uden kontaminering fra andre cerebellare regioner og kan dyrkes til yderligere undersøgelser.

Abstract

Mikrodissektion er en ny teknik, der kan isolere specifikke områder af et væv og eliminere forurening fra cellulære kilder i tilstødende områder. Denne fremgangsmåde blev først anvendt i studiet af Nestin-udtrykkende progenitorer (Neps), en nyligt identificerede population af celler i cerebellum ydre vækstlag (EGL). Brug mikrodissektion i kombination med fluorescerende cellesortering (FACS) blev en ren population af Neps indsamles separat fra konventionelle granule neuron prækursorer i EGL og fra andre kontaminerende Nestin-udtrykkende celler i cerebellum. Uden mikrodissektion ville funktionelle analyser af Neps ikke have været muligt med de nuværende metoder til rådighed, såsom Percoll gradientcentrifugering og laser capture mikrodissektion. Denne teknik kan også anvendes til brug med forskellige væv, der indeholder enten genkendelige regioner eller fluorescens-mærkede celler. Vigtigst er det, en stor fordel ved denne microdissection teknik er, at isolerede celler er levende og kan dyrkes til yderligere eksperimenter, som i øjeblikket ikke er muligt med andre beskrevne metoder.

Introduction

Lillehjernen består af flere cellelag, som hver indeholder forskellige celletyper. Under udvikling, indeholder EGL prolifererende granulat neuron forstadier (BNI), mens den molekylære lag og Purkinje lag indeholder Bergmann Glia og Purkinje neuroner hhv. Dybt i lillehjernen ligger den hvide substans, der indeholder neurale stamceller (NSC) og oligodendrocytter 1.

Sonic pindsvin (Shh) spiller en afgørende rolle i reguleringen af cerebellar udvikling og i særdeleshed det fremmer udbredelsen af BNI via binding til sin receptor Patched (PTC), en negativ regulator af Shh signalering 2-4. Afvigende aktivering af Shh signalering genererer medulloblastoma (MB), den mest almindelige maligne hjernetumor hos børn 5,6.

PTC mutant MB transgene musemodeller er stærke værktøjer til studiet af MB og udvikle tumorer ligner menneskelig MB 7,8. Ved hjælp af dissemus, blev det opdaget, at BNI er cellen af oprindelse for pindsvin-typen MB 7. Endvidere, ud over BNI, har vi for nylig identificeret en unik population af neuronale progenitorceller inden EGL af udviklingen i lillehjernen, der også kan give anledning til MB. Disse celler udtrykker høje niveauer af typen VI mellemliggende filamentprotein, Nestin, og kaldes Neps 9. Neps ligger inden for den dybe del af EGL og findes transient kun i neonatal cerebellare udvikling. De er forpligtet til at granulatet cellelinje som BNI, men adskiller sig, som de er i hvile og ikke udtrykker Math1, et veletableret markør for konventionelle BNI 10. Desuden Neps give anledning til MB mere effektivt end BNI efter aktivering af Shh signalvejen 9, hvilket gør dem et hidtil ukendt oprindelse til MB tumorigenese.

Vi har tidligere isolerede Neps fra cerebellare EGL på postnatal dag 4 (P4) ved mikrodissektion teknikher 9 beskrevne. Mikrodissektion via direkte mikroskopisk visualisering af væv giver mulighed for specifik dissektion af cerebellare EGL. Dette er nødvendigt, da Nestin også udtrykkes ved NSC i cerebellare hvide substans og ved Bergmann glia i den molekylære lag 1,7,11,12, og det var afgørende, at disse celler ikke medtages, da de ville forvirre analyse. Celler isoleret fra Mikrodissekterede væv umiddelbart kan anvendes til molekylær analyse, eller de kan dyrkes til yderligere anvendelser.

For at hjælpe i specielt microdissecting EGL og til yderligere oprensning Neps blev Math1-GFP (grønt fluorescerende protein) mus krydset med Nestin-fælles fiskeripolitik (cyan fluorescerende protein) mus. Transkriptionsfaktoren Math1 specifikt udtrykt af BNI, og GFP-ekspression er tydeligt i EGL 9,13. Mus Nestin-FFP udtrykker en nuklear form for fælles fiskeripolitik og kan nemt visualiseres i den molekylære lag 9,14. Sammen GFP og FFP ekspression skabe grænser for mikrodissektion af EGL (se figur 1). FFP-positive Neps blev derefter isoleret ved FACS efter enzymatisk dissociering af dissekerede EGLS.

I øjeblikket er den mest anvendte metode til at isolere celler fra EGL er Percoll-gradientcentrifugering af hele cerebellar væv 15,16. Denne fremgangsmåde er imidlertid ikke i stand til helt at udelukke Nestin +-cellepopulationer fra det molekylære lag og hvid substans, og derfor ikke kan anvendes til undersøgelse af Neps. Laser capture microdissection, som bruger overførsel af laserenergi til fjernelse af celler af interesse, er en anden metode, der anvendes til at isolere specifikke celler i en heterogen væv 17,18 men indfangede celler kan kun anvendes til udvinding af DNA, RNA og protein og er ikke stand til at blive dyrket.

Denne protokol giver en måde til specifikt at isolere en levende, ren population af Neps fra EGL.Denne teknik kan også anvendes på forskellige vævstyper, der enten genkendelige anatomiske arkitektur eller fluorescensmærkede celler / områder. Derfor er den største fordel ved at inkorporere denne nye mikrodissektion teknik i celleisolering protokoller er, at cellerne kan isoleres fra bestemte vævsområder at fjerne kontaminerende tilstødende væv og cellerne kan opsamles umiddelbart til analyse eller dyrkes til andre anvendelser.

Protocol

Anvendelse af dyr i denne protokol er blevet udført i overensstemmelse med procedurer, der er godkendt af Fox Chase Cancer Center Animal Care og brug Udvalg. 1. Fremstilling af instrumenter, løsninger og Dækglas Clean to sæt af # 5 fine pincet, et sæt af # 7 fine buet pincet, et stort kirurgisk saks, en microdissecting saks, en spatel og en hulske. Anbring instrumenterne i en selvlukkende sterilisering pose og autoklave. Hold instrumenter pose indtil den er klar til brug. </l…

Representative Results

Som vist i figur 1A blev cerebellare skiver fremstillet ud fra P4 Math1-GFP-mus / Nestin-FFP, hvor cerebellare EGL var domineret af GFP-udtrykkende BNI og den molekylære lag blev beriget med FFP-positive glialceller. Til isolering Neps der er placeret i den dybe del af EGL, blev skiver mikrodissekeres mellem EGL og den molekylære lag (langs stiplet linje, figur 1A). Dissekeret EGLS (figur 1B), blev derefter opsamlet enzymatisk dissociation efterfulgt…

Discussion

Den her beskrevne mikrodissektion metode er den første procedure stand til at isolere en ren population af levende celler til anvendelse i molekylære og funktionelle analyser. Som det fremgår af Li et al. 9. Neps opnået ved denne metode kan dyrkes og inkorporeres i forskellige eksperimenter og på grund af deres høje renhed, kan også anvendes til microarray analyse.

Det er meget vigtigt at tage tid til at blive dygtige med denne mikrodissektion teknik. Ne…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne vil gerne takke James Oesterling til flowcytometri bistand. Denne forskning blev støttet af en bevilling fra det amerikanske National Cancer Institute (R01-CA178380, ZY) og en US National Institutes Postdoc uddannelse tilskud (5T32CA009035-37, Lwy).

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Neurobasal media Gibco 21103-049
PDL Millipore A-003-E
ultra pure low melting temperature agarose Invitrogen 16520-050
DPBS Gibco 14190144

Referencias

  1. Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
  2. Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22, 103-114 (1999).
  3. Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
  4. Riobo, N. A., Manning, D. R. Pathways of signal transduction employed by vertebrate Hedgehogs. Biochem J. 403, 369-379 (2007).
  5. Dahmane, N., et al. The Sonic Hedgehog-Gli pathway regulates dorsal brain growth and tumorigenesis. Development. 128, 5201-5212 (2001).
  6. Marino, S. Medulloblastoma: developmental mechanisms out of control. Trends Mol Med. 11, 17-22 (2005).
  7. Yang, Z. J., et al. Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells. Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).
  8. Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants. Science. 277, 1109-1113 (1997).
  9. Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nat Neurosci. 16, 1737-1744 (2013).
  10. Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
  11. Sutter, R., et al. Cerebellar stem cells act as medulloblastoma-initiating cells in a mouse model and a neural stem cell signature characterizes a subset of human medulloblastomas. Oncogene. 29, 1845-1856 (2010).
  12. Sotelo, C., Alvarado-Mallart, R. M., Frain, M., Vernet, M. Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells. J Neurosci. 14, 124-133 (1994).
  13. Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).
  14. Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).
  15. Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).
  16. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
  17. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
  18. Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nat Protoc. 1, 586-603 (2006).

Play Video

Citar este artículo
Yuelling, L. W., Du, F., Li, P., Muradimova, R. E., Yang, Z. Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection. J. Vis. Exp. (91), e52034, doi:10.3791/52034 (2014).

View Video