عزل بالسكان خلية متميزة من المخيخ تطوير من تسليخ مجهري
Summary
الأسلاف، معربا عن Nestin هي التي تم تشخيصها حديثا من السكان الأسلاف العصبية في المخيخ النامية. باستخدام تقنية تسليخ مجهري المقدمة هنا في تركيبة مع الفلورسنت تنشيط الفرز الخلية، ويمكن تنقية هذا السكان الخلية مع عدم وجود تلوث من المناطق الأخرى للدماغ ويمكن تربيتها لمزيد من الدراسات.
Abstract
تسليخ مجهري هو أسلوب الرواية التي يمكن عزل مناطق معينة من الأنسجة وإزالة التلوث من مصادر الخلوية في المناطق المجاورة. وقد استخدمت هذه الطريقة لأول مرة في دراسة Nestin، معربا عن الأسلاف (NEPS)، يبلغ عدد سكانها التي تم تشخيصها حديثا من الخلايا في الطبقة الخارجية للدماغ جرثومي (EGL). باستخدام تسليخ مجهري في تركيبة مع الفلورسنت تنشيط الفرز الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية)، تم جمع السكان نقية من NEPS بشكل منفصل عن التقليدية السلائف الحبيبية الخلايا العصبية في EGL من تلويث وخلايا Nestin، معربا عن الأخرى في المخيخ. دون تسليخ مجهري، والتحليلات الوظيفية للNEPS لم يكن ممكنا مع الأساليب المتاحة حاليا، مثل التدرج Percoll الطرد المركزي والقبض على الليزر تسليخ مجهري. ويمكن أيضا أن تطبق هذه التقنية للاستخدام مع الأنسجة المختلفة التي تحتوي إما مناطق معروفة أو خلايا fluorescently المسمى. الأهم من ذلك، الميزة الرئيسية لهذا microdissectioن الأسلوب هو أن الخلايا المعزولة يعيشون ويمكن تربيتها لمزيد من التجارب، وهو حاليا غير ممكن مع الأساليب المذكورة الأخرى.
Introduction
يتكون المخيخ من طبقات خلايا متعددة، تحتوي على كل أنواع الخلايا متميزة. خلال التنمية، وEGL يحتوي المتكاثرة السلائف الحبيبية الخلايا العصبية (الناتج القومي الإجمالي) في حين أن طبقة طبقة الجزيئية والعصبية تحتوي على بيرجمان الدبقية والخلايا العصبية، على التوالي. في عمق المخيخ تكمن المادة البيضاء، والذي يحتوي على الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) و oligodendrocytes 1.
القنفذ الصوتي (شش) يلعب دورا حاسما في تنظيم وتطوير المخيخ على وجه الخصوص، أنه يعزز انتشار الناتج القومي الإجمالي عن طريق ملزمة لمستقبله مرقع (PTC)، منظم السلبي للشش يشير 2-4. تفعيل الشاذة من شش الإشارات يولد نخاعي (MB)، ورم خبيث في الدماغ الأكثر شيوعا في الأطفال 5،6.
المؤسسة العامة للاتصالات MB متحولة نماذج الماوس المعدلة وراثيا هي أدوات قوية لدراسة MB وتطوير الأورام تشبه MB 7،8 البشري. باستخدام هذهالفئران، تم اكتشاف أن الناتج القومي الإجمالي هي خلايا المنشأ للالقنفذ من نوع MB 7. وعلاوة على ذلك، بالإضافة إلى الناتج القومي الإجمالي، حددنا مؤخرا السكان فريد من الأسلاف العصبية داخل EGL من المخيخ النامية التي يمكن أن تؤدي إلى MB. هذه الخلايا التعبير عن مستويات عالية من النوع السادس بروتين خيوط وسيطة، Nestin، وصفته NEPS 9. وتقع NEPS داخل الجزء العميق من EGL وجود عابر فقط خلال تطوير المخيخ الولدان. انهم ملتزمون النسب الخلية الحبيبية حيث الناتج القومي الإجمالي ولكنها متميزة كما هي هادئة ولا تعبر Math1، علامة راسخة لالناتج القومي الإجمالي التقليدية 10. بالإضافة إلى ذلك، NEPS تثير MB أكثر كفاءة من الناتج القومي الإجمالي بعد تفعيل شش 9 إشارات الطريق، مما يجعلها أصل الرواية لMB تكون الأورام.
نحن معزولة سابقا NEPS من EGL المخيخ في يوم ما بعد الولادة 4 (P4) بواسطة تقنية تسليخ مجهريالموصوفة هنا 9. تسليخ مجهري عبر التصور المجهري المباشر من الأنسجة يسمح للتشريح محدد من EGL المخيخ. وهذا أمر ضروري كما يعبر Nestin أيضا NSCs في المادة البيضاء للدماغ وبيرجمان الدبقية في طبقة الجزيئية 1،7،11،12 وكان من الأهمية بمكان أن هذه الخلايا لم تدرج، لأنها نخلط التحليل. خلايا معزولة عن الأنسجة microdissected يمكن استخدامها على الفور للتحليل الجزيئي أو أنها يمكن تربيتها لمزيد من التطبيقات.
للمساعدة في microdissecting تحديدا EGL، ومواصلة تنقية NEPS، وقد عبرت Math1-GFP (ببروتين أخضر) الفئران مع Nestin-CFP (سماوي البروتين الفلوري) الفئران. عامل النسخ يتم التعبير Math1 تحديدا من الناتج القومي الإجمالي وGFP التعبير مرئيا بوضوح في EGL 9،13. الفئران Nestin-CFP تعبر عن شكل النووي الحراجية ويمكن تصور بسهولة في طبقة الجزيئية 9،14. معا، وGFP CFP التعبير خلق الحدود للتسليخ مجهري من EGL (انظر الشكل 1). تم NEPS CFP إيجابية ثم عزل من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية، في أعقاب تفكك الأنزيمية للEGLs تشريح.
حاليا، الأسلوب الأكثر استخداما جيدا لعزل الخلايا من EGL هو Percoll الطرد المركزي التدرج من الأنسجة دماغ كامل 15،16. هذه الطريقة، ومع ذلك، غير قادر على أن تستبعد كليا السكان الخلية Nestin + من الطبقة الجزيئية والمادة البيضاء، وبالتالي لا يمكن استخدامها لدراسة NEPS. القبض على الليزر تسليخ مجهري، والذي يستخدم نقل طاقة الليزر لإزالة الخلايا من الفائدة، هو طريقة أخرى تستخدم لعزل خلايا معينة داخل الأنسجة غير المتجانسة 17،18 ولكن يمكن فقط أن تستخدم الخلايا والقبض لاسترداد DNA، RNA والبروتين وليس قادرة على أن تكون مثقف.
يوفر هذا البروتوكول طريقة لعزل وحيا، والسكان نقية من NEPS من EGL على وجه التحديد.ويمكن أيضا أن تطبق هذه التقنية لأنواع الأنسجة المختلفة التي إما بنية تشريحية أو التعرف fluorescently المسمى خلايا / المناطق. ولذلك، فإن الميزة الرئيسية لدمج هذه التقنية الجديدة في تسليخ مجهري بروتوكولات العزل الخلية أن الخلايا يمكن أن تكون معزولة من مناطق الأنسجة محددة للقضاء على تلوث الأنسجة المجاورة والخلايا يمكن جمعها فورا للتحليل أو مثقف لتطبيقات أخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقة تسليخ مجهري الموصوفة هنا هو الإجراء الأول قادرا على عزل السكان نقية من الخلايا الحية لاستخدامها في التحليلات الجزيئية والوظيفية. كما يتبين من لي وآخرون. 9، NEPS التي حصلت عليها هذه الطريقة يمكن تربيتها ودمجها في التجارب المختلفة وبسبب نقاء عالية…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر جيمس Oesterling عن التدفق الخلوي المساعدة. وأيد هذا البحث من خلال منحة من المعهد الأمريكي الوطني للسرطان (R01-CA178380، ZY) ومنحة المعاهد الوطنية الأمريكية للتدريب ما بعد الدكتوراه (5T32CA009035-37، LWY).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| PDL | Millipore | A-003-E | |
| ultra pure low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| DPBS | Gibco | 14190144 |
Referencias
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22, 103-114 (1999).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
- Riobo, N. A., Manning, D. R. Pathways of signal transduction employed by vertebrate Hedgehogs. Biochem J. 403, 369-379 (2007).
- Dahmane, N., et al. The Sonic Hedgehog-Gli pathway regulates dorsal brain growth and tumorigenesis. Development. 128, 5201-5212 (2001).
- Marino, S. Medulloblastoma: developmental mechanisms out of control. Trends Mol Med. 11, 17-22 (2005).
- Yang, Z. J., et al. Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells. Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).
- Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants. Science. 277, 1109-1113 (1997).
- Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nat Neurosci. 16, 1737-1744 (2013).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
- Sutter, R., et al. Cerebellar stem cells act as medulloblastoma-initiating cells in a mouse model and a neural stem cell signature characterizes a subset of human medulloblastomas. Oncogene. 29, 1845-1856 (2010).
- Sotelo, C., Alvarado-Mallart, R. M., Frain, M., Vernet, M. Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells. J Neurosci. 14, 124-133 (1994).
- Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).
- Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nat Protoc. 1, 586-603 (2006).
