Los métodos para mediciones de capacitancia celulares inscritos en ratón suprarrenal Cromafín Cell

La transmisión sináptica es mediada por exocitosis de vesículas sinápticas que contienen neurotransmisores, y estas vesículas debe someterse a endocítica reciclado local dentro de la terminal nerviosa para mantener la comunicación neuronal en el largo plazo. Dado el papel esencial de la transmisión sináptica en el cerebro, la comprensión de la maquinaria molecular que constituye el ciclo de la vesícula sináptica es una base esencial para lograr una mejor comprensión en la comunicación celular en su conjunto. Entre los sistemas modelo de célula, la célula cromafines adrenales ha proporcionado algunas de la visión más definitivo en la maquinaria molecular subyacente de reciclado de vesículas sinápticas. La exocitosis, el paso final en la liberación de neurotransmisores, se ha estudiado y se examinaron mediante el uso de la célula cromafines adrenales ^1,2 inmensamente. De hecho, la mayoría de los jugadores moleculares que orquestan la formación, la orientación, soporte, y la fusión de los gránulos secretores han sido identificados debido a la aplicación de divtécnicas ERSE en células cromafines ^1. Además, al proporcionar una oportunidad para permitir la resolución de una sola vesícula de la maquinaria de proteína implicada en la exocitosis, la cromafín sigue siendo un modelo de gran alcance para hacer frente a las cuestiones de la fusión de vesículas ^3.

Mediciones de capacitancia de célula-adjunta se utilizaron primero en la solución de fusión de una sola vesícula durante la exocitosis ^3. Exocitosis de vesículas tan pequeñas como ~ 60 nm de diámetro se ha demostrado que puede detectar mediante mediciones de admisión de la membrana celular con la técnica de patch clamp en la configuración de células vinculada ^4-7. De admisión se define como una medida de la facilidad con que un circuito o dispositivo permitirá que fluya una corriente; es la inversa de la impedancia. Por lo tanto, las mediciones de admitancia proporcionan una comprensión de la capacitancia de la membrana. Esto se logra mediante la incorporación de la membrana vesicular en la membrana plasmática; esta incorporación revela cambios en la superficiezona ^8. Cada vesícula fusión causa un aumento gradual en ^9,10 capacitancia de la membrana. Además, esta medida admisión proporciona la conductancia de la membrana y la conductancia poro de fusión durante un evento de exocitosis ^3. Como esta técnica ha proporcionado una herramienta única en la identificación de la cinética de una sola vesícula durante la exocitosis, nuestro laboratorio ha aplicado recientemente este concepto para detectar la endocitosis de vesículas individuales ^11,12.

Nuestro interés específico es mediada por clatrina endocitosis (CME), que ha sido considerada como un componente fundamental de limpieza en muchas células y ¹³ como una vía principal para la endocitosis de las vesículas sinápticas en los terminales neuronales ^14,15. CME es conocido por ser biológicamente importante, sin embargo, su cinética no quedan bien entendidos debido a limitaciones técnicas en el seguimiento de eventos endocíticas singulares. Dadas las similitudes en los mecanismos exocytic entre las células cromafines y neuronas ^1, es plausible que los mecanismos de fisión en células cromafines pueden aplicar probablemente a la endocitosis de vesículas sinápticas en las neuronas. Las mediciones de capacitancia de célula-adjunto se han utilizado para controlar los eventos de endocítica individuales y analizar la cinética de fisión, que la mayoría de los métodos son incapaces de resolver. En nuestras grabaciones celulares inscritos, una onda sinusoidal a 20 kHz se superpone sobre el potencial de mantenimiento, y la corriente de salida se separa en la conductancia de la membrana en un canal y la membrana capacitancia en el otro canal de dos fases amplificador lock-in ^{de 16 18.} A partir de los cambios en la conductancia de la membrana y la capacitancia, se puede calcular la cinética de la fisión de poros, que probablemente corresponde a la membrana tubular cuello que conecta la vesícula internalización a la membrana plasmática antes de la vesícula de pinzamiento. En conjunto, esta técnica nos da la oportunidad de examinar los mecanismos de regulación de la fisión de vesículas durante CME.