Assay הדמיה תוכן גבוה לזיהוי של טוקסין עצבי המעכבים

טוקסין החיידק Clostridium מייצר רעל עצב טוקסין, אחד מהרעלים הביולוגיים החזקים ביותר הידוע לאדם ^1. ישנם 7 קפסיד bont מובהקים (בונט / AG). בונט / A-גאל לגרום שיתוק בצומת העצבית-שהרירית בשל proteolysis המורכבת מלכודת ^2,3. proteolysis המלכודת מונעת איחוי שלפוחית-קרום מוליך עצבי, ולכן לוקים הנוירוטרנסמיטר exocytosis ^4. יעד המלכודת הספציפי תלוי בסרוטיפ bont המסוים המעורב בתהליך שכרות. בונט / וונט / E תדבק SNAP-25 ואילו דבק בונט / C שני SNAP-25 וsyntaxin ^5. Synaptobrevin ידבק קפסיד הנותרים (המכונה גם חלבון הקרום קשור-שלפוחיות (נצלנית). בונט / נבחר לפיתוח assay כפי שהוא אחראי לשיעור גבוה של בוטוליזם באופן טבעי ויש לו משך הזמן הארוך ביותר של פעולה ^6. פיתוח של מולקולה קטנה תרופות נגד ונט / היא מטרה עיקרית לתכנית גילוי תרופות ו נצלה שיטות המבוסס על יעד מסורתיים לזהות מעכבי proteolytic האתר פעילים ^{7, 8-10.} עם זאת, היצירה של מעכבי אתר פעילים עם פעילות קשת רחבה נגד קפסיד מרובה ויעילות לאחר החשיפה צפויה להיות מאתגרת.

לכן יש לנו יישמתי גישה חדשנית, פנוטיפי תרופת גילוי שמשתמשת במחשוף בונט SNAP-25 כנקודת סיום פונקציונלית לזהות מולקולות קטנות שיכול לחסום שיכרון הנוירון מוטורי בתיווך בונט. SNAP-25 נדרש לשחרור הנוירוטרנסמיטר, כהשפלה של SNAP-25 הוא חיזוי של שיתוק וקטלני in vivo. לדוגמא, הקרנה מבוססת תאים עלולה להוביל לגילוי של מאפננים חדשים של גורמים הסלולר אחראים לאיון רעלן או עיכוב של מסלולי רעלן בתוך תאים ממוקדים. גורם חשוב בהתפתחות assay פנוטיפי הוא הבחירה של מודלים ביולוגיים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. Wדואר ואחרים תארו את הנוירונים עכבר גזע עוברי (ES) שמקורן בתאים מנוע כי לשחזר את האופי החיסוני של תאי עצב מוטוריים ראשוניים, ובכלל זה הביטוי של SNAP-25 ^{11- 13.} חשוב לציין, המערכות הסלולריות אלה רגישות מאוד לונט / שיכרון ולהפגין מחשוף תלוי-מינון של SNAP-25 בתגובה לגידול בריכוזי של רעלן ^11,12. הנוירונים המוטוריים המובחן גם הם מיוצרים בכמויות שמספיקות לניתוח מבוסס צלחת תפוקה גבוהה ואפשרו את העיצוב של מערך של מבחני סלולריים.

Assay פנוטיפי הוא שיטת immunofluorescence ניצול שני נוגדנים שונים לכמת מחשוף של באורך מלא בא לידי ביטוי באופן אנדוגני SNAP-25 במהלך ונט / שיכרון של תרבות הנוירון מוטורי עכבר. מסוף carboxyl ונט / נוגדן מחשוף רגיש (BACS) שמכיר באורך מלא רק SNAP-25 מאפשר ההערכה של bont proteolysis תיווך / של SNAP-25ביטוי במנוע עכבר נוירונים ^10. תרשים סכמטי של assay HCI מתואר באיור 1.

תאי הגזע העובריים של עכבר צלחת 20,000 הבדיל (MES) / גם ב96 צלחות ליזין מצופה פולי-D היטב ולשמור בתקשורת בידול מסוף הנוירון מוטורי 5-7 ימים.

מנהל 1. מתחם ושיכרון בונט /

לבצע את כל העבודה הבאה במתחם BSL2 על מנת לעמוד בהנחיות ה- CDC / NIH.

1. הכן 10 פתרונות מניות מ"מ של כל מתחם ספרייה ב100% DMSO בפוליפרופילן 96 צלחות גם. השתמש במניית 10 מ"מ להכין צלחת דילול ביניים שהיא פי 10 גדולים יותר מריכוז ההקרנה הרצויה. הכן 100 צלחת ביניים אום על ידי מחלק 10 מניות מ"מ לתוך צלחת 96-היטב ולדלל אותו ל -100 UM באמצעות תקשורת ותרבות. להפריש 10 μl של התרכובות על 90 μl של תקשורת על התאים ^11. תבדוק את התרכובות בשעה 10 בריכוז סופי אום ולהבטיח את האחוז הסופי של DMSO אינו עולה על 0.5%.
2. לבצע את כל ההרבעהies שעושה שימוש בתאים חיים ורעלן פעיל ברמת בטיחות ביולוגית 2 תנאים. החלף את המדיה הישנה ב96-גם צלחות עם 80 μl של תקשורת בידול מסוף הטרי באמצעות פיפטה במדריך 12 ערוץ. לבצע שאיפה ולוותר צעדים על ידי שורות כדי למנוע חשיפה של התאים ללא תקשורת לאוויר הסביבה.
3. Pretreat תאים עם תרכובות שלפני היישום של רעלן על ידי תוספת של 10 μl של 10x תרכובות מצלחת המקור באמצעות פיפטה 12 ערוץ, ואחריו ערבוב על ידי שאיפה (פעמיים). לכל צלחת 96-היטב, לטפל בשני טורים של 6 בארות עם 10x DMSO המדולל בתקשורת כדי לשרת גבוהה כאות ובקרת אות נמוכה. הטור ללא טיפול בונט מציג את הרמה הגבוהה ביותר של האורך המלא SNAP-25 (שליטת אות גבוהה). פנק את הטור השני עם bont לבד (ללא כל תרכובות) כשליטת אות הנמוכה. השתמש שליטה נמוכה כדי לבחון את היעילות של המחשוף בונט של SNAP-25 וזיהוי שלה עם נוגדן BACS (איור 2).
4. דגירה תאים עם תרכובות למשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס ו -6% CO ₂ בתרבית תאי החממה.
5. הכן עצבי טוקסין מ1 מ"ג / מיליליטר במקור מסחרי פוספט שנאגרו מלוח (PBS) למניות 10x סופיות עובדות על ידי דילול עם תקשורת בידול מסוף.
6. ליזום שיכרון על ידי הוספת 10 μl של 10x בונט / המניה לתוך בארות המיועדות לבקרת טיפול ואות נמוכה בעזרת פיפטה רבה (איור 2). פנק את הבארות יועדו כגבוהה שליטה עם תקשורת לבד.
7. לטהר את כל כלי הפלסטיק חד-פעמים ואחרות שבאים במגע עם בונט / במהלך המחקר על ידי טבילה בתמיסת היפוכלוריט 0.825% במים לפחות 20 דקות. לבצע את כל ההליכים בארונות בטיחות ביולוגיים ולטהר אזורי עבודה לפני ואחרי ניסויים עם 5% חומר ניקוי חיטוי חומרי ניקוי כגון פתרון MicroChem.
8. תווית הצלחות ברורה כדי לציין את הרעל וincubצלחות אכלו טופלו בnM 1 / L בונט / 4 שעה על 37 מעלות צלזיוס ו -6% CO ₂ באינקובטור תרבית תאים. להציג שילוט מתאים כדי ליידע עמיתים שהרעל נמצא בשימוש במעבדה.
9. התחנה בונט / מחשוף פרוטאוליטים על ידי קיבעון מתנול. הסר מדיה המכילה רעלן ותרכובות מכל טוב עם פיפטה רבה וזורקים בפתרון אקונומיקה 10%. להוסיף מתנול הקרח הקר (100 μl) ישירות לכל טוב.
10. דגירה צלחות במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר (RT) על מנת לאפשר קיבוע להתרחש.
11. לאחר קיבוע, להתמודד בבטחה עם ריאגנטים המושלכים (נחשב מנוטרל) עם פרוטוקולי 1 רמת בטיחות ביולוגית וזורקים בהתאם.
12. בטל מתנול ולהשתמש של PBS 100 μl לשטוף את התאים ורעננותם לפני immunostaining. בצע שני שוטף PBS נוסף.
13. לאחר השטיפה של הדבר, לעזוב את PBS בבארות, צלחות חותם עם סרט דבק microplate ולאחסן ב 4 ° C עד לניתוח. צלחות חנות ב 4 ° C FOr כמה ימים.

2. Immunostaining

הליך immunostaining הוא, פעולה רב שלבי עבודה אינטנסיבית הכוללת מחזורים חוזרים ונשנים מגיב לוותר / לשאוב ושטיפת צלחת נרחבת שעלולות להוביל להקדמה האפשרית של השתנות intraplate וinterplate משמעותיות. גישה חצי אוטומטי מוחלת לחסוך את הזמן של אנשי מעבדה, להגדיל את תפוקת assay, ולמזער immunostaining שונות.

1. השתמש בתחנת עבודה אוטומטית מצויד בראש 96-היטב מסוגל להעביר נפחים של עד 250 μl ומשולב עם זרוע רובוטית תפסן לעבור מעבדתי למקומות שונים על הסיפון המודולרי (ראה חומרים וציוד) לפרוטוקול זה.
   1. הסיפון מודולרית נועד לארח סוגים שונים של מעבדתי ויכול לתמוך בעד 11 פריטים בכל זמן נתון. מטפל microplate האוטומטית מצויד במערה microplate מגזין כפול כדי להחזיק ולתפעל עד 50 צלחות בכל מחזור.
   2. תחנת העבודה האוטומטית ממוקמת בתוך ארון בטיחות ביולוגי Class II המיועד לציוד אוטומציה מעבדה כדי לספק לעקרות ובטיחות. עבור immunostaining האוטומטי, הסיפון מסודר כפי שמוצג באיור 3 כדי לאפשר גישה מגיב בהתאם לצורך וללא התערבות אדם.
2. צלחות טרום עומס המכילות תאים קבועים למגזין הצלחת ומעביר לסיפון כנדרש לפעילות טיפול נוזלי. השתמש מצויד עם 250 טיפים μl ראש 96 פיפטה כדי לשאוב PBS מהבארות עד 10 μl. Permeabilize קרומים תאיים כדי להקל על נוגדן מחייב למטרות תאיות עם חיץ permeabilization (0.1% Triton-X 100). לוותר חיץ permeabilization (100 μl) לתוך זה גם לפני החזרת הצלחות למגזין האחסון השני של מערה microplate לדגירת 15 דקות בטמפרטורת חדר (RT).
3. הסר חוצץ permeabilization וPEשטיפת צלחת rform עם PBS (פעמיים) כפי שתוארה לעיל בשלב 1.13.
4. לאחר השלב לשטוף האחרון, להסיר את PBS חיץ ולוותר של חיץ חסימה המכיל 1% בסרום סוס ו -0.1% Tween 20 בPBS 100 μl לכל microplates לפני החזרתן למגזין הצלחת 1 שעתי דגירה על RT.
5. השתמש בשני נוגדנים ראשוניים לimmunostaining: נוגדן BACS אנטי עכבר הארנב polyclonal, לגילוי אורך מלא אנטי-III נוגדן טובולין SNAP-25 וחד שבטי עכבר לצורך זיהוי של תאי עצב (ראה חומרים וציוד). לאחר 60 דקות של דגירה, להסיר את חיץ החסימה ולוותר 50 μl של 4ug / מיליליטר של נוגדן BACS ו0.5 מיקרוגרם / מיליליטר של III-טובולין בחסימת מאגר לכל הצלחות.
6. דגירה 1 שעות ב RT להסיר את הנוגדנים הראשוניים ולשטוף 3 פעמים עם PBS של 100 μl מכיל 0.05% Tween (PBST).
7. השתמש IgG אנטי עכבר שכותרתו עם אלקסה פלואוריד 647 לדמיין IgG -III טובולין ונגד הארנב מתויג עם אלקסה Fluor 568 לדמיין את נוגדן BACS. הכן שני הנוגדנים כדילול / מיליליטר 2 מיקרוגרם בחסימת מאגר ולוותר 50 μl של התערובת לתוך כל טוב.
   הערה: הנוגדנים משני שנבחרו לimmunostaining מסומנות עם fluorophores שונה ומאפשרת גילוי של אור הניאון נפלט באורכי גל שונים באמצעות ערוצים שונים בתוך הגלאי של Imager התוכן הגבוה.
8. דגירה עבור שעה 1 ב RT. לשאוב את הנוגדנים משני ולשטוף 3 פעמים עם PBST של 100 μl.
9. לאחר השטיפה של הדבר, להוסיף צבע של PBS המכיל Hoechst (32 מיקרומטר) 100 μl להכתים את ה- DNA לזיהוי גרעינים.
10. לאטום את הצלחות עם סרט בלתי חדיר אור כדי להגן על fluorophores מphotobleaching. ניתן לאחסן צלחות ב 4   ° C במשך שבועות ללא אובדן משמעותי של אות.

3. הדמיה

הערה: בצע רכישת תמונה באמצעות תוכן גבוה ההדמיה SysTEM (ראה חומרים וציוד).

1. מפרט של הגדרות Imager תוכן גבוהות:
   1. בחר סוג פלייט, פריסה, מספר תחומים, מטרה: גריינר u ברור, פורמט 96 גם, 16, 20X מים בהתאמה.
   2. ערוצים נבחרים: EX עירור גרעין: 405 ננומטר כערוץ 4; ציטופלסמה EX: 644 ננומטר כערוץ 2; EX אנטיגן הספציפי ערוץ נוגדן: 561 ננומטר כערוץ 3 וכוח עירור הגדרה של כל לייזר, ניסוי התקנה כמו 2 חשיפות, חשיפה 1 עם עירור אחד ב644 ננומטר, חשיפה 2 עם שני עירורים ב 405 ננומטר ו561 ננומטר. בחר binning כBin2.
   3. השתמש בבארות שליטה גבוהות לאופטימיזציה חשיפה בעוצמה המרבית כערוץ SNAP-25 ובארות שליטה נמוכות לעצמה מינימאלית.
   4. התאם את החשיפה, כך שהעצמה של כל ערוץ היא כמחצית מרמת הרוויה (2,000-2,500 יחידות יחסית).
   5. זהה את מטוס Z האופטימלי בערוץ מסכת תא באמצעות סקריפט תיקון דלתא. ראה Figure 5 לתוצאות לאחר immunostaining והדמיה. נתוני יצוא לשרת שבי תוכנת ניתוח תמונה המתגוררת.

4. ניתוח תמונה (איור 6)

הערה: השלבים הבאים מתארים יישום של אלגוריתמי תוכנת קולומבוס.

1. בחר אלגוריתם מתאים למגזר האובייקטים העיקריים (גרעינים). במידת הצורך, להתאים את סף רקע ופרמטרים לעומת זאת. תוכנת קולומבוס מספקת 4 שיטות זיהוי גרעינים. בחר את השיטה שגרעיני קטע בצורה מדויקת על ידי בחינה ויזואלית בדיקת גרעינים מפולחים (בF שיטת 6 א igure M נבחר).
2. בחר את אלגוריתם neurite (CSIRO neurite ניתוח 2) למגזר neurites אם נדרש, להתאים את הפרמטרים סף רקע ולעומת זאת להסרת רקע. ראה 6 ב איור לפרמטרים המשמשים לאיתור neurites.
3. זהה את אזורי neurite (מגזרי neurite) basאד על אובייקטים משני (neurites) באמצעות הרחבת פיקסל -3 של ערוץ טובולין β-III (Alexa קמח 640) כמסכה (איור 6 ג).
4. חישוב עוצמת ערוצי האות (SNAP-25, (Alexa קמח 568) לאזור neurites וערוץ β-III טובולין (איור 6 ד & 6-ה).
5. בחר פרמטרים רצויים ליצוא, כגון אורך neurite, עוצמות ממוצעת של SNAP-25, טובולין β-III, מספר גרעינים, מספר קטע neurite, וכו '(6F איור).
6. העברת צלחות ממלגזות צלחת באמצעות הרובוט והעומס לImager התוכן הגבוה לרכישת תמונה.

5. ניתוח נתונים:

כדי להעריך את חוסנו של assay נועד, לחשב את הפרמטרים הבאים מהניסוי מבוסס הצלחת.

1. אות (S) לרקע (B): S B = עוצמת אומרת עוצמת שליטת אות גבוהה) / אומר / שליטה אות נמוכה
<li> מקדמים שונה (CV) של אות ורקע (כדי למדוד את האחידות של האות הספציפית): קורות חיים = (סטיית תקן (/ ממוצע של מדגם SD)) * 100 (%), כדי לקבוע את השונות בטיפול נוזלי, ריאגנטים, וכו '
2. אות לרעש: S = (ממוצע עוצמת האות - אומר עוצמת שליטת אות נמוכה) / SD שליטה נמוכה
   1. לחשב הגורם "Z עם שיכרון מחצית מצלחת 96-היטב ושכרות מדומה של החצי השני. Z '= 1 - 3 * (SD שליטה אות גבוהה + SD שליטה אות נמוכה) / (ממוצע של שליטת אות גבוהה - ממוצע של שליטת אות נמוכה). לניתוח נוסף של נתוני ההקרנה, לנרמל חלק מפרמטרי הגלם העיקריים על בסיס צלחת כדי לאפשר השוואה בין לוחות ובין ימים השונים של ניסויים.
3. אחוזים ממחשוף, המשקפים ירידה של האות הקשורים באורך מלא SNAP-25 זוהה על ידי נוגדן ספציפי (BACS):% מחשוף = 100% * (MEAעוצמת n שליטה אות גבוהה - עוצמת המדגם) / אומרת עוצמת שליטת אות גבוהה.
4. אחוזים מהעיכוב של מחשוף:% עיכוב = 100% * (עוצמת המדגם - אומר עוצמת שליטת אות נמוכה) / (ממוצע עוצמת שליטת אות גבוהה - כלומר עוצמת שליטת אות נמוכה).

נתונים מפקדים גבוהים ונמוכים יצרו שתי אוכלוסיות נפרדות עם ההבדל של שני חציונים עולה על 3 סטיות תקן (איור 7 א). המטרה של תהליך המיון היא למצוא תרכובות באוכלוסיית המדגם עם ערכים קרובים יותר לאוכלוסיית ביקורת חיובית, בהנחה של התפלגות נורמלית באוכלוסיית המדגם (איור 7 ב, (i)). נקודות נתונים, כי הם 3 סטיות תקן מעבר לממוצע נחשבות שונות סטטיסטית מהרעש וסווגו כ" להיט "פעיל (איור 7 ב (ב), תיבות אדומות). תרכובות המסווגים כ" להיטים "תהיה כפופות יותר לבחינת אישור נוספת במחקרים עתידיים. איור 7 ב (ב) מציג את זיהוי של להיטים חיוביים באוכלוסייה של הדגימות מקבוצת משנה נציג של צלחות ההקרנה. כל 4 הנקודות שערכים נמוכות מ( דגימות חציון - 3 * SD של הדגימות) היו שייכים לאותו המעכב שהבחין במקומות שונים בתוך 4 צלחות הקרנה שונות. מעכב זה הוכיח הגנת SNAP-25 חזקה נגד ונט /, כפי שמוצג באיור 5.

איור 1: Workflow להקרנת מתחם בassay בונט / HCI.

איור 2:. מפת 96-גם הצלחת לassay HCI בארות שליטה גבוהה (ורוד) טופלו ב- 0.5% DMSO כשליטה היחידה ובארות נמוכות שליטה (כחול) טופלו ב- 1 ננומטר בונט / ו -0.5% DMSO. בארות מדגם (ירוקה) טופלו עם רעלן 1nM ו -10 מיקרומטר של תרכובות ב0.5% DMSO. עמודים החיצוניים ושורות (האפורה) לא שמשו בשל אי התאמה עם הצלחת מותאמת למחצלת וחוסר היכולת של מטרת מים הטבילה 20X לבארות קצה תמונה.

איור 3:. העיצוב של סיפון תחנת עבודה האוטומטי עבור assay immunostaining חיץ חסימה, נוגדן ראשוני, נוגדן המשני וכתמים סלולריים היו לוותר בלוחות פוליפרופילן 96, גם כדי לצמצם את האובדן מגיב נפח מת. PBS חולק במגש מסוגל להחזיק 300 מיליליטר. הסעפת המשמשת לשאיפת פסולת נוזלית מוצגת בתמונת השיבוץ.

איור 4: צילום מסך של ניסיון Imager תוכן הגבוה שהוקם.

ng> איור 5: טופלו הדמיה תוכן גבוהה של SNAP-25 מחשוף בתאי עצב מוטורי עכבר נגזר ES תאים עם 1 ננומטר בונט / עם ובלי תוספת של 1 מיקרומטר של מעכב (Toosendanin) ¹⁴ או אינה מטופלת כראוי ללא הרעלן.. SNAP-25 זוהו עם נוגדן BACS. בערוץ אחר, תאי עצב התגלו באמצעות נוגדן β-III טובולין ליצור מסכה של neurites לSNAP-25 ניתוח תמונה. זוהי תמונה מייצגת אחת מאחת התמונות 16 נלקחו מניתן גם. הכחול מציין גרעינים הוכתמו Hoechst 33342, אדום הוא אות BACS וירוק הוא האות β-III-טובולין. תמונות התקבלו עם האופרה כפי שתוארו. בר גודל: 10 מיקרומטר

איור 6: צילומי מסך המציגים את שלבים שונים בצנרת ניתוח תמונה.

העוצמה הגבוהה של עצבי טוקסין והקלות היחסית של חימושם הביאה סיווגם כקטגוריה (העדיפות הגבוהה ביותר) סוכני biothreat על ידי המרכז האמריקאי לבקרת מחלות ומניעתן. למרבה הצער, אין FDA אישר תרופה נגד שכרות בונט לאחר רעלן הופנם על ידי תאי העצב המוטוריים. כל מנגנון druggable שמקדם את ההחלמה עצבית משיכרון bont עלול להוביל לפיתוח טיפול פוטנציאלי להגנה הן על השירותים וציבוריים המזוינים נגד איום ביולוגי. במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול assay HCI מפורט לסינון מעכבים של רעלים קטלניים כמו בונט /. היבט יוצא דופן של assay זה הוא מסירה קפדנית של רעלים ויישום של פרוטוקולי בטיחות ביולוגיים קפדניות כדי להבטיח את הבטיחות במעבדה. בזהירות רבה צריכה להיות מופעלת בזמן שרעלן פעיל נמצא בשימוש. בונט / איון באמצעות קיבוע מתנול וdecontaminati microplateעם 10 אקונומיקה% ו -5% מגבוני פני השטח הם שלבים עיקריים המאפשרים microplates להסרה מארונות בטיחות ביולוגי להערכה במורד הזרם בסביבות רמת 2 מעבדה בטיחות ביולוגית.

בשל גודלו ההולך ומתרחב של ספריות מתחם בשילוב עם התרחבות איטית הנוירון מוטורי (מספר תאים), מבחני HCI ליריבים עצבי נוטים לרוץ על פני כמה שבועות. זה מחייב את השונות בין הלוחות ועל פני זמן יש לבטל או ממוזערות. בפרוטוקול זה אנו מספקים שיטות אוטומציה עבור immunostaining, רכישת תמונה וניתוח כדי להפחית את שונות assay. אמינות ועקביות בהמשך יכולים להיות מושגת על ידי האוטומציה של משימות שגרתיות הקשורות לפרוטוקול זה כולל ציפוי תא, כביסה, וקיבעון. הקבוצה שלנו כרגע בוחנת את ההשפעה של שיפורים אלה במטרה לשלב אותם לתוך הפרוטוקול שלנו בעתיד הקרוב.

בדו"ח זה, אנו מתארים SNAP-25assay מחשוף באמצעות הדמיה תכולה גבוהה למדידת הקרינה היחסית של SNAP-25 ללא פגע בתאי עצב מוטורי. assay זה משתמש BACS ונוגדני טובולין β-III כדי לזהות באורך מלא SNAP-25 וטובולין β-III בהתאמה ^11. טובולין β-III משמש כסמן לזיהוי באופן ספציפי תאי עצב (איור 4). בעוד דבק בונט / SNAP-25 ומקטין את אות SNAP-25, מולקולות קטנות המעכבות כל חלק של תהליך זה לשפר SNAP-25 אות בassay ההדמיה. כassay זה תלוי באותות הקרינה המופקים מSNAP-25 המפוזרות על פני רב neurites הזעירה, תמונות באיכות גבוהה הן הכרחיים. לפיכך, מיקרוסקופים אוטומטיים המייצרים תמונות ברזולוציה גבוהה confocal מומלצים (איור 4). אנחנו ללכוד באופן שיגרתי 6-16 שדות / גם בפורמט 96-גם בעת שימוש במטרת מים טבילת 20X. מספר הדמיה של השדה תלוי במספר הכולל של neurites נדרש generatדואר תוצאות מובהקות סטטיסטי.

אלגוריתמי ניתוח תמונת מודולרי נוצלו כדי לחלץ נתונים פרמטרים מרובים (איור 6). אלגוריתמי ניתוח תמונה מודולרית קולומבוס קלים יחסית לייצר עבור תרחישי ניתוח פשוט. לניתוח או עיצוב של פרמטרים ספציפיים לקריאות מורכבות יותר מסובכים, ניתן להשתמש בסקריפטים מבוססים Acapella בסביבת האופרה, כמו גם בתוך ההקשר של קולומבוס. בנוסף לעוצמות הקרינה המתקבלות מערוצי טובולין SNAP-25 וβ-III, שאנו אוספים באופן שגרתי פרמטרים נוספים כגון מספר כולל של תאים (מדד עקיף לcytotoxicity), אורך neurite, neurite הסתעפות, ונקודתי קצה אחרות לכמת בריאות עצבית במהלך assay. נתונים של נקודות קצה הגלם מיוצאים לתוכנת ניתוח סטטיסטית לניתוח נתונים נוסף ובחירה פגעה (איור 7). הנתונים שהוצגו כאן מדגים את היכולת של assay HCI להיות efficiently מנוצל להקרנה פנוטיפי בחיפוש אחר מעכבי ונט / תוך שימוש במודל הנוירון מוטורי רלוונטי מבחינה פיזיולוגית.