小鼠模型的非侵入性成像检测和监测卵巢癌复发

耶鲁大学实验动物管理和使用委员会批准的所有的体内工作。与患者的同意下进行，并批准了耶鲁大学医学院的人类调查委员会的样品采集。 1.准备人卵巢癌细胞之前制备的细胞以确保所需的下述的子宫内注入所有材料都准备好，易于使用。一旦注入细胞悬液，因为它已准备就绪。 生长在培养荧光标记的癌细胞。我们使用一个F2代的人CD44 + / + MyD88的上皮性卵巢癌的细胞，这是我们以前表明窝藏干性性能如致瘤性，化学抗性及对于肿瘤修14-19高容量的。生成这些细胞稳定表达mCherry荧光（F2-mCherry， 图1），使用慢病毒从聚乙烯亚胺产生的（PEI）协议20,21。 于注射的当天，通过胰蛋白酶消化收获细胞并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗一次。 确定细胞计数和悬浮细胞以3×10 6细胞/50μl的适当的生长培养基。对卵巢癌细胞，我们使用的RPMI 160有10％FBS。使细胞保持在培养器，直到准备注入，但不保持时间超过15分钟。这是足以让一只老鼠注射。 人卵巢癌细胞2.在无胸腺裸鼠宫内​​注射液注意，下面的步骤需要来自第二人的帮助。此外，由于这是存活手术中，使用无菌的手术器械。这生存术过程大约需要10到15分钟。 麻醉，用2％异氟醚的鼠标。 7〜8周龄的无胸腺裸小鼠中，通常使用。 确认该动物是COMPLET由俭用手指或镊子垫脚的伊利麻醉。动物应该是完全无反应开始前，手术的痛苦。 将麻醉小鼠腹侧的无菌纱布垫与头离调查。 用棉花尖端涂药，以防止干燥时在麻醉下应用软膏的眼睛。 立即插入头连接到一个异氟烷蒸发器（ 图2A），一鼻锥系统。这也提供了在整个手术过程中麻醉。 消毒的左（或右）的腹部用酒精垫（ 图2B），接着加入碘侧然后将无菌外科手术布在外科手术部位。 用无菌手术剪和镊子进行1-2厘米的皮肤切口上的鼠标（ 图2C）的左下象限。 解除肌肉和做一个切口，以达到腹膜。 <利>解剖的斜肌以暴露腹腔。 找到并确认左宫角（ 图2D）。 使用无菌止血钳，夹紧角（ 图2E）的两个前和后侧面。放置右输卵管下面的前夹紧和后夹紧权利子宫颈以上。 有第二人注入细胞悬液。将装有细胞的针，在45°角沿垂直于喇叭（ 图2F）。非常缓慢地注入50微升细胞悬浮液放入子宫角的内腔中。 取出针和释放前夹紧。 松开后夹紧和替换子宫角在腹腔内。 使用合成的可吸收缝合关闭腹膜和使用组织粘合剂闭合皮肤。 从鼻锥取下鼠标放回笼子。如有必要，修改的床上用品，以确保CLEA手术在n笼。确保所有的动物都清醒和主动离开前无人值守。 提供布洛芬在饮用水中的第48小时的手术后的0.11毫克/毫升。随后，换上普通的饮用水。 注意：如果无胸腺裸鼠的使用和皮肤，使用组织粘合剂代替缝合关闭，这是没有必要的手术后，分离小鼠。 SCID小鼠中更积极的，并且可以具有被分离。 密切监测切口可能的感染部位，由于开放性伤口。 3.检测早期腹膜内卵巢癌的活体内成像确定腹腔IP疾病的体内成像存在了现场。多模态动物轮作系统（MARS）用于本协议。 从MI软件中访问MARS捕获软件。该模块提供在火星协调控制拍摄设置，同时充分利用了成像系统的捕获和分析能力。使用前，开发的旋转协议在步骤3.4单视图影像优化模式每个单独的拍摄设置。 输入预定的捕捉值。对于荧光采集，使用10秒曝光，2×2像素合并，光圈2.8，视场120毫米，例如：550纳米，EM：600纳米过滤器捕获设置。对于X射线拍摄，使用10秒曝光，2×2像素合并，光圈2.8，视场120毫米，35 kVp的0.4mm的铝过滤器捕获设置。 保存参数步骤3.2作为独立的会话文件。 由来自系统接口获取窗口选择创建/编辑协议按钮创建一个旋转序列协议。 选择之前保存的荧光会议文件，并保存为第一步。接下来，选择相应的透视会话文件，并保存为第二步。 与第一步中选择， 使用 Set 旋转系列从之前图像捕捉弹出菜单中设置所需的起始角度，范围和增量，以确保功能的无缝可视化。特定的值包括为-180°起始角，且具有375度，和15度的增量。 保存该协议，然后单击完成按钮初始化MARS和地图对应于每个角度增量的步进电机的位置。 如下所述对齐的腹侧，背侧和横向视图定位在动物支持具有特定度的旋转的具体动物要使用软件协议执行最后的校准。 麻醉用医用空气和2％异氟醚的混合物以2升/分钟的流速鼠标。 从采集菜单中选择预览按钮，弹出肩选项卡启动校准。使用反射光模式，而不是多波长或X-RAŸ方式来加快这一进程。 选择加载鼠标选项，并继续通过一系列的定位菜单。 确保可折叠鼻锥的管很端是在鼻锥凹部，然后将鼠标在俯卧的取向，其在鼻锥头。 开始校准在朝下的动物的腹侧面的0度位置。使用旋转系统上的两个旋钮来定位动物，使其居中显示在预览窗口中。 重复上述过程，提示-180， – 90，90，和180度的位置，然后单击完成 。 通过点击主窗口获取的执行协议按钮执行以前保存的协议。在协议的执行，观察状态窗口为当前捕获，暴露时间，以及整体协议的步骤提供实时状态更新。 个人组装成图像使用电影格式旋转的软件。使用显示控制来调整亮度/对比度，透明度，以及设置显示颜色的荧光信号。 在导出的介绍* .AVI文件格式的图像的最终序列。 4.政府1日和第二轮化疗以下的ip肿瘤检测由MARS，使用标准的二维定位确定的感兴趣区域（ROI）的初始肿瘤负荷区域。这是，如第5节如下所述。一旦初始的投资回报率是确定的，施用4剂量的12毫克/公斤的紫杉醇的ip每三天装在成像系统中的透明动物托盘进行。紫杉醇是从Hospira的公司获得一个现成的配方去与cremaphor车辆。我们以前表明，此治疗方案具有抗异种移植模型显著的抗肿瘤活性与载体对照相比，诱导彻底根除可检测吨umor负担20。然而，由于该疾病的性质和ip肿瘤复发几天治疗结束后20。 监测对治疗的反应通过使用标准的二维定位成像每隔3天。 紫杉醇的第四给药后，将小鼠归类为具有完全应答率（ROI小于2000），部分应答（减少来自步骤4.1，疾病稳定所得到的初始投资回报率高达35％（最多50上升，从最初的投资回报率％ ），或进展与基于所观察到的荧光信号处理（增加从最初的投资回报率超过50％）。 对于小鼠完全缓解，经影像学每​​3天监测复发。一旦复发观察（ROI =初始投资回报率在4.1步），再启动在4.1中描述的第二轮紫杉醇。 小鼠局部疾病，疾病稳定，或那些与治疗的进展， 第 4 次剂量后3天重新开始第二轮紫杉醇紫杉醇。同样，图像这些每三天。 5.监测对治疗的反应使用标准的二维定位麻醉小鼠用医用空气和2％异氟醚的混合物以2升/分钟的流速进行成像。 将麻醉的小鼠中个体nosecones的头在成像室（ 图3）内的透明动物托盘。 输入为荧光预定的曝光参数（10秒曝光，将2×2像素合并中，f-停止2.8，视场角120毫米，例如：550纳米，青霉：600纳米）和X-射线（20秒曝光，将2×2像素合并，光圈2.8，视场120毫米，35 kVp的0.4mm的铝过滤器）。 点击暴露在连续拍摄两幅图像。 目视检查和利益分析的区域中打开布鲁克MI软件的图像。 6.图像叠加和分析为了给博进行有效的比较的时间过程的图像序列处理的所有前景和背景的图像类似的第视觉和定量分析。 在软件中打开两个前景图象（ 即荧光）和背景图像，并选择在顶部（ 图4A）从窗口菜单中瓷砖功能。 处理的前景图像;打开顶部栏（ 图4A，红色箭头）的图像显示选项卡，设置最小/最大值为260和5000，分别为（ 图4A，蓝色箭头） 注：图片显示范围不同于研究根据图像中捕捉荧光信号强度来研究。图片应该对比与最小值/最大值，将显示肿块，但没有显示出从动物的自发荧光背景。 下次打开自动ROI的标签从导航面板左侧（ 图4B，红色箭头），然后从菜单中选择新建投资回报率设置（ 图4（c），红rrow）。调整设置以使用阈值算法在630级灰度并取消限制规模最大，以确保公司记录所有潜在的投资回报率（ 图4C）。 注：阈值设置可能会有所不同，从研究，研究根据图像中捕捉荧光信号强度。图像阈值化，以定量从肿瘤块信号尚未从动物的自体荧光背景测量信号。 从形象展示的窗口中选择屏蔽功能。现在仅对应于具有等于的值或超过630级灰度的阈值的像素的区域将被显示。 要查看的定量结果中选择顶部菜单栏和选择显示选项卡（ 图4D，红色箭头）的分析选项卡。 从显示菜单中选择序列号，求和，平均值和地区的复选框，然后单击确定。 保存图像，这样的值可以是前移植沿着一旦所有荧光图像进行处理。 其次，突出透视图像，再从顶部的菜单栏打开的图像显示。设置为最小值，最大值和伽玛值赋予鼠标骨架的最佳视觉表现。 注意：由于没有定量的是，在X射线图像的时间序列中的每个单独的X射线图像可以被处理执行（ 即最小值，最大值和灰度值），以产生数据集的最好看的表示。 再次与透视图像高亮选择覆盖复选框，并从下拉菜单（ 图4E）选择相应的荧光图像的文件名 ​​。 要提取叠加输出，然后从导航菜单（ 如图4B所示，蓝色箭头）左侧的注释标签。选择适当的选项卡添加任何额外的数据或文本最后添加的力度比例尺这样的荧光强度数据可以快速地从IM确定年龄。 一旦标注完成突出显示所有批注页面上显示的对象，并从编辑菜单中选择复制在上面粘贴的叠加图像数据转换成相应的文件（ 例如 Word，PowerPoint和/或Photoshop）。 重复步骤6.1- 6.11的序列中所有对荧光和X射线图像。确保安全的所有图像关闭之前。 对于最终的定量打开所有的荧光图像的同时，并沿顶部的窗口菜单中选择平铺。 下一步选择导出所有打开的文档来查看数据。 注：在没有Excel程序中，取消选择该选项卡。 MI将生成一个制表符分隔的文本可以被转移到一个适当的计算机进行进一步的分析（ 即 .txt）文件。