Modèle murin pour l'imagerie non invasive pour détecter et surveiller l'ovaire récurrence du cancer

Le Comité de protection et d'utilisation des animaux institutionnelle Université Yale approuver tout le travail in vivo décrit. Prélèvement des échantillons a été réalisée avec le consentement du patient et approuvé par le Comité enquêtes sur les droits de l'École de médecine de l'Université Yale. 1. Préparation des cellules cancéreuses d'ovaire humain Avant de préparer les cellules assurez-vous que tous les documents requis pour l'injection intra-utérine décrit ci-dessous sont prêts et facilement accessible. Injecter la suspension cellulaire dès qu'il est prêt. Cultiver les cellules cancéreuses marquées par fluorescence dans la culture. Nous utilisons une génération F2 de CD44 humain + / MyD88 + cellules de cancer ovarien épithélial, qui nous l'avons déjà démontré à abriter des propriétés stemness tels que tumorigénicité, la chimiorésistance et de grande capacité pour la réparation de la tumeur 14-19. Ces cellules ont été générés pour exprimer de façon stable mCherry fluorescence (F2-mCherry, Fig. 1) en utilisant des lentivirus produit à partir de la polyéthylènimine(PEI) 20,21 protocole. Le jour de l'injection, récolter les cellules par trypsinisation et les laver une fois avec du tampon phosphate salin (PBS). Déterminer le nombre de cellules et les cellules en suspension à 3 x 10 6 cellules / 50 ul dans un milieu de croissance approprié. Pour les cellules de cancer de l'ovaire, nous utilisons 160 RPMI avec 10% de FBS. Maintenir les cellules dans l'incubateur jusqu'à ce que prêt à injecter, mais ne gardez pas plus de 15 min. Cela est suffisant pour une seule injection de la souris. 2. Injection intra-utérine de cellules cancéreuses ovariennes humaines chez la souris nude athymiques Notez que la procédure suivante nécessite l'assistance d'une deuxième personne. En outre, étant donné que cette opération est de survie, en utilisant des instruments chirurgicaux stériles. Cette procédure de chirurgie de survie devrait prendre environ 10 à 15 min. Anesthésier les souris en utilisant 2% d'isoflurane. De 7 à 8 semaines d'âge des souris nude athymiques est généralement utilisé. Assurez-vous que l'animal est completEly anesthésiés en pinçant le coussinet plantaire avec les doigts ou une pince. L'animal doit être entièrement non-réponse à la douleur avant de commencer l'opération. Placez la face ventrale de souris anesthésiée sur une compresse de gaze stérile avec la tête loin de l'enquêteur. Appliquer une pommade sur les yeux avec un applicateur coton-tige pour prévenir la sécheresse alors que sous anesthésie. Immédiatement insérer la tête dans un système de cône de nez relié à un vaporisateur isoflurane (Fig. 2A). Cela offre l'anesthésie pendant toute la procédure chirurgicale. Désinfecter la gauche (ou à droite) des tampons d'alcool à l'aide de l'abdomen (fig. 2b), suivie par l'iode puis placez un champ opératoire stérile sur le site chirurgical. Utilisation des ciseaux et des pinces chirurgicales stériles faire une incision de 1-2 cm de la peau sur le quadrant inférieur gauche de la souris (Fig. 2C). Soulevez le muscle et faire une incision afin d'atteindre le péritoine. <li> disséquer le muscle oblique afin d'exposer la cavité abdominale. Localiser et identifier la corne utérine gauche (Fig. 2D). Utilisation hémostatique stérile, serrer les deux côtés antérieur et postérieur de la corne (Fig. 2E). Placez la pince antérieure droite en dessous de la trompe de Fallope et la pince postérieure au-dessus du col de l'utérus. Demandez à une autre personne injecter la suspension cellulaire. Placez l'aiguille contenant des cellules, à 45 ° angle perpendiculaire à la corne (Fig. 2F). Très injecter lentement 50 pi de suspension de cellules dans la lumière de la corne utérine. Retirez l'aiguille et relâchez la pince antérieure. Relâchez la pince postérieure et remplacer la corne utérine dans la cavité abdominale. Fermez le péritoine en utilisant une suture absorbable synthétique et fermer la peau à l'aide d'un adhésif de tissu. Débranchez la souris de l'ogive et le lieu de retour dans la cage. Si nécessaire, changez la literie pour assurer un CLEAn cage après la chirurgie. Assurez-vous que tous les animaux sont éveillés et actifs avant de quitter sans surveillance. Fournir de l'ibuprofène à 0,11 mg / ml de l'eau potable pour la première chirurgie de poste de 48 heures. Ensuite, remplacer avec de l'eau de consommation régulière. Remarque: si la souris nude athymiques sont utilisés et la peau est fermée à l'aide d'adhésif à la place de sutures des tissus, il est nécessaire de séparer la souris après la chirurgie. Souris SCID sont plus agressifs et peuvent être séparés. Suivre de près le site de l'incision pour une éventuelle infection due à une plaie ouverte. 3. Détection précoce de cancer de l'ovaire au stade intra-péritonéale par Live In Vivo Imaging Déterminer la présence d'une maladie ip intra-péritonéale par live imagerie in vivo. Un système de rotation des animaux multimodal (MARS) est utilisé dans ce protocole. Accès au logiciel de capture MARS à partir du logiciel MI. Ce module fournitcontrôle coordonné de la MARS capturer les paramètres tout en tirant parti de capture et d'analyse des capacités du système d'imagerie. Optimiser les réglages de capture individuels pour chaque modalité en utilisant une imagerie mono-vue avant d'élaborer le protocole de rotation à l'étape 3.4. Entrée prédéterminée des valeurs de capture. Pour fluorescence capture, utiliser 10 exposition de sec, 2 x 2 binning, f-stop de 2,8, FOV 120 mm, ex: 550 nm, em: 600 nm paramètre filtre de capture. Pour la capture des rayons X, utilisez une exposition de 10 sec, 2 x 2 binning, f-stop de 2,8, FOV 120 mm, 35 kV, 0,4 mm Al paramètre filtre de capture. Enregistrer les paramètres dans l'étape 3.2 en tant que fichiers de session individuelles. Créer un protocole de séquence de rotation en sélectionnant le bouton / Créer Modifier les protocoles de la fenêtre acquérir de l'interface du système. Sélectionnez le fichier de session de fluorescence enregistré précédemment et enregistrer en tant que première étape. Ensuite, sélectionnez le fichier de session X-ray correspondant et enregistrer en tant que deuxième étape. Avec la première étape de sélection, utilisez le jeu de rotationSérie dans le menu pop-up Image Capture Avant de fixer le départ angle, la portée et augmentation souhaitée pour assurer une visualisation parfaite de fonctionnalités. Les valeurs spécifiques comprennent un angle de départ de -180 degrés, une gamme de 375 degrés, et un incrément de 15 degrés. Enregistrez le protocole et cliquez sur le bouton Terminé pour initialiser le MARS et de cartographier les positions du moteur pas à pas correspondant à chacun des incréments d'angle. Effectuer le calibrage final comme décrit ci-dessous pour aligner la ventrale, dorsale et des vues latérales de l'animal spécifique positionné dans le support de l'animal avec des degrés spécifiques de rotation pour être utilisé par le protocole de logiciel. Anesthésier les souris à l'aide d'un mélange d'air médical et 2% d'isoflurane à un débit de 2 L / min. Début de l'alignement en sélectionnant le bouton Aperçu à partir du menu Acquire pour faire apparaître l'onglet Rotator. Utilisez la modalité de la lumière réfléchie plutôt que l'onde multiples ou X-ramodalités y à accélérer le processus. Sélectionnez l'option Souris de charge et de passer par la série de menus de positionnement. Assurez-vous que la fin tubé de la coiffe pliable est dans le creux de coiffe et placer la souris dans le sens ventral avec la tête dans la coiffe. Commencer le calibrage à la position 0 degré à la face ventrale de l'animal vers le bas. Utilisez les deux boutons sur le système de rotation pour positionner l'animal de sorte qu'il apparaît centré dans la fenêtre de prévisualisation. Répétez le processus invité à -180, – 90, 90, et 180 degrés positions et cliquez sur Terminé. Exécuter le protocole précédemment enregistré en cliquant sur ​​le bouton de protocole d'exécution de la fenêtre principale acquérir. Au cours de l'exécution du protocole, observer une fenêtre d'état fournissant des mises à jour de statut en temps réel pour la capture actuelle, Durée de l'exposition, et pas l'ensemble du protocole. Assembler des images individuelles dans un format de film en utilisant laRotation logiciel. Utilisez les contrôles d'affichage pour régler la luminosité / contraste, la transparence, et pour définir la couleur d'affichage pour le signal de fluorescence. Export de la séquence finale des images dans le format de fichier * .AVI pour la présentation. 4. Administration de 1 er et 2 e cycle de chimiothérapie Suite à la détection de la tumeur ip par MARS, déterminer la région de la charge initiale de la tumeur d'intérêt (ROI) en utilisant le positionnement en deux dimensions standard. Ceci est réalisé sur une plaque transparente munie d'animaux dans le système d'imagerie, comme décrit ci-dessous dans la section 5. Une fois que le retour sur investissement initial est déterminé, administrer 4 doses de 12 mg / kg ip Paclitaxel tous les trois jours. Le paclitaxel est obtenu à partir de Hospira Inc. dans une formulation prête à aller avec Cremaphor comme véhicule. Nous avons précédemment démontré que ce régime de traitement a une activité anti-tumorale significative par rapport au modèle de xénogreffe par rapport au contrôle du véhicule et induit une éradication complète des détectable tumor charge 20. Toutefois, en raison de la nature de la maladie, les tumeurs ip reviennent quelques jours après la fin du traitement 20. Surveiller la réponse au traitement par imagerie de tous les 3 jours en utilisant le positionnement en deux dimensions standard. Après la quatrième dose de paclitaxel, classer les souris comme ayant une réponse complète (ROI inférieur à 2000), réponse partielle (jusqu'à 35% de diminution de la ROI initial obtenu à l'étape 4.1, une maladie stable (jusqu'à 50% d'augmentation de la ROI initiale ), ou la progression d'un traitement (augmentation de plus de 50% par rapport à un retour sur investissement initial) en fonction du signal de fluorescence observé. Pour les souris présentant une réponse complète, surveiller la récidive par imagerie tous les 3 jours. Une fois la récidive est observée (ROI = initiale ROI dans l'étape 4.1), re-lancer le second tour de paclitaxel comme décrit au paragraphe 4.1. Chez les souris atteintes de la maladie partielle, stabilisation de la maladie, ou qui ont progressé de traitement, ré-initier deuxième série de Paclitaxel 3 jours après la 4ème dosede paclitaxel. De même, l'image de ces trois jours. 5. Suivi réponse au traitement en utilisant le positionnement standard à deux dimensions Anesthésier les souris à imager à l'aide d'un mélange d'air médical et 2% d'isoflurane à un débit de 2 L / min. Placez la tête des souris anesthésiées à pointes coniques individuels dans le bac transparent animal dans la chambre d'imagerie (Fig. 3). Entrée des paramètres d'exposition prédéterminées pour la fluorescence (10 exposition s, 2 x 2 binning, f-stop 2,8, FOV 120 mm, ex: 550 nm, em 600 nm) et de rayons X (exposition de 20 s, 2 x 2 binning, f-stop de 2,8, FOV 120 mm, 35 kV, 0,4 mm Al filtre). Cliquez Exposer à capturer deux images en séquence. Ouvrir les images dans le logiciel Bruker MI pour l'inspection et la région d'intérêt de l'analyse visuelle. 6. Superposition des images et de l'analyse Pour établir une comparaison valable pour boanalyse quantitative et e visuelle du processus de la séquence d'images en fonction du temps de toutes les images d'avant-plan et d'arrière plan de façon similaire. Ouvrez la fois l'image de premier plan (c.-à fluorescence) et l'imagerie de fond dans le logiciel et sélectionner la fonction de tuile dans le menu de la fenêtre en haut (Fig. 4A). Pour traiter l'image de premier plan; ouvrez l'onglet d'affichage des images sur la barre du haut (Fig. 4A, flèche rouge) et définir les valeurs min / max à 260 et 5000, respectivement (Fig. 4A, flèche bleue) Remarque: La gamme d'affichage d'image diffère d'une étude à fonction de l'intensité du signal de fluorescence capturés en images. Les images doivent être en contraste avec un min / max qui montrera des masses tumorales, mais pas montrer de fond autofluorescence de l'animal. Suivant ouvert Auto-ROI onglet dans le panneau de navigation sur la gauche (Fig. 4B, flèche rouge) et sélectionnez le jeu New ROI dans le menu (Fig. 4C, un rougeRROW). Réglez les paramètres à utiliser l'algorithme de seuil à 630 niveaux de gris et désactivez l'Limiter la taille max pour que tous les potentiels de retour sur investissement sont enregistrées (Fig. 4C). Remarque: Les paramètres de seuil peut varier d'une étude à fonction de l'intensité du signal de fluorescence capturés en images. Images seuillés pour quantifier le signal de masses tumorales encore pas mesurer le signal de fond de l'autofluorescence de l'animal. De l'intérieur de la fenêtre d'affichage d'image sélectionner la fonction de masque. Maintenant que la zone correspondant aux pixels ayant des valeurs égales ou supérieures à la valeur seuil de 630 niveaux de gris sera affiché. Pour voir les résultats quantitatifs sélectionnez l'onglet Analyse de la barre de menu du haut et le Sélectionnez l'onglet d'affichage (Fig. 4D, flèches rouges). Dans le menu Affichage sélectionner le numéro de série, somme, la moyenne, et la région de cases à cocher, puis cliquez sur OK. Enregistrez l'image de sorte que les valeurs peuvent être exporté une fois le long de toutes les images de fluorescence sont traités. Ensuite, sélectionnez l'image à rayons X et à nouveau ouvrir l'affichage de l'image dans la barre de menu du haut. Définir les valeurs de min, max et le gamma pour donner la meilleure représentation visuelle du squelette de la souris. Note: Étant donné qu'aucune quantification est effectuée sur les images radiographiques chaque image aux rayons X de la séquence de temps peut être traité (c.-à-min, max et les valeurs gamma) pour produire la meilleure représentation à la recherche de cet ensemble de données. Encore une fois avec l'image à rayons X mis en évidence sélectionner la case à cocher Overlay et choisissez le nom de fichier d'image de fluorescence correspondant dans le menu déroulant (Fig. 4E) vers le bas. Pour extraire la sortie superposée, sélectionnez l'onglet Annotations dans le menu de navigation (Fig. 4B, flèche bleue) sur la gauche. Sélectionnez languettes appropriées pour ajouter des données ou du texte supplémentaire et enfin ajouter la barre d'échelle d'intensité de sorte que les données d'intensité de fluorescence peuvent être rapidement déterminées à partir de l'imâge. Une fois que les annotations sont terminées point culminant de tous les objets sur la page Annotations et sélectionnez Copier dans le menu Edition en haut et coller les données d'image qui interfèrent dans le fichier approprié (par exemple Word, PowerPoint et / ou Photoshop) pour l'affichage. Répétez les étapes 6.1- 6.11 pour toutes les paires de fluorescence des rayons X et d'images dans la séquence. Assurez-vous de la sécurité de toutes les images avant de les fermer. Pour la quantification finale ouvrir toutes les images de fluorescence à la même heure et sélectionnez Tile dans le menu Fenêtre sur le haut. Ensuite, sélectionnez les documents d'exportation tous ouverts pour afficher les données. Remarque: En l'absence de programme Excel, désélectionner l'onglet. MI va générer un onglet texte délimité (par exemple .txt) qui peuvent être transférées à un ordinateur approprié pour une analyse plus approfondie.