Summary

Трансплантация кожи хвоста изучать Аллогенная лимфоцитов CD4 ответов у мышей

Published: July 25, 2014
doi:

Summary

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

Abstract

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention.

In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-γ in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Introduction

Трансплантация твердых органов, таких как кожа, сердце и почки в настоящее время является стандартной процедурой в медицинской практике во всем мире 1. Успешно пересаженные органы могут быть отвергнуты активации получателя иммунной системы, в которой признается основные антигены гистосовместимости донора. Поэтому пересаженные пациентам необходимо лечение с иммуносупрессивных препаратов 2. Аллогенная трансплантация кожи у мышей было установлено Medawar и коллегами в 1955 году и был полезен для выявления целевых молекул позже описаны как главный комплекс гистосовместимости (МНС) класса I и II. С тех пор модель пересадка кожи была постоянно модифицировать и адаптировать для изучения роли Т-клеток подмножеств и актуальность химической и биологической вмешательства в подавлении отторжение трансплантата 2-4. Кожа из уха и туловища труднее подготовить и более восприимчивы к гипоксии и некроза, чем хвостовой кожи 5; ОднакоПроцедура трансплантации аналогично. Кроме того, мониторинг трансплантации кожи хвоста легко из-за характерной текстурой волос кожи.

Эта статья предусматривает подробную процедуру для МНС класса II несоответствия трансплантации хвост кожи, что позволяет для изучения различных аспектов CD4 + Т-клеточного отторжения трансплантата и толерантности у мышей. Естественный трехточечный мутации в МНС класса II молекул IA B (называемая IA BM12) 6-9 достаточно, чтобы вызвать отказ от аллотрансплантатов кожи в C57BL / 6 мышей 8. BM12 молекула IA активирует CD4 + Т-клеток с различными αβ-Т-клеточного рецептора (TCR) цепи от мышей C57BL / 6, среди которых Vα2Vβ8-TCR-специфические Т-клетки, выявленные в того, чтобы генерировать TCR-трансгенной мыши 10. Адоптивный перенос Vα2Vβ8-TCR-специфических Т-клеток был использован для создания модели отказ в иммунодефицитных C57BL / 6 RAG2 – / – мыши пересаженные с И.А. BM12 кожи.

Генетические различия между донором и реципиентом повлиять на исход принятия трансплантации и отвержения. Существуют различные типы трансплантатов: аутотрансплантаты являются трансплантации, изъятых у самого человека-реципиента; syngrafts и аллотрансплантаты являются трансплантации от генетически идентичных и генетически неродственных индивидуумов соответственно. Принятие различных аллогенных трансплантаций органов было продемонстрировано химической и биологической вмешательства у пациентов и мышиных моделях 11,3,4. В основной подход, анти-CD3 антитела обработанных мышей C57BL / 6 показали длительное выживание И.А. BM12 хвостовой кожи (неопубликованные данные). Истощение CD4 + и CD8 + Т-клеток перед трансплантацией у мышей-реципиентов в результате принятия МНС класса I и II несогласованных трансплантатов (Откр. в 12). Интересно, отторжение трансплантатов кожи зависит от присутствия CD4 + </sup> Т-клетки (rev. в 12). В этой модели, ориентированные на конкретные взаимодействие между различными иммунных клеток, блокируя костимулирующие молекулы с антителами или подавления с регуляторных Т-клеток может индуцировать толерантность (неопубликованные данные). В самом деле, блокируя как CD40 и CD28 привело к долгосрочной толерантности аллотрансплантата кожи 13,14.

Трансплантация Хвост-кожа легко выполнить и легко контролировать по сравнению с трансплантацией других органов. Кроме того, пересадка хвост кожи легко приготовить и менее восприимчивы к ишемии, чем другие ткани кожи. В отличие от вводимых анестетиков, использование анестезирующего газа (изофлуораном) во время трансплантации сокращает как порядок и время восстановления получатель. Curling трансплантата хвост кожи, что может привести к неполному заживления ран и отторжения трансплантата, предотвращается путем нанесения клея ткани. Кроме того, хвост-кожа трансплантации модель И.А. BM12 исключительно активизирует CD4 <sup> + Т-клетки в обоих иммунокомпетентных и иммунодефицитных мышей (одного и того же генетического фона) содействие интерпретацию результатов.

Этот протокол описывает надежный, воспроизводимый и легко контролируется модель мыши, которая позволяет химической и биологической вмешательства. Модель предназначена для исследования отказ и терпимости индукцию трансплантации хвост кожи.

Protocol

В этом видео-публикации и протокола, все процедуры животных были проведены в соответствии с протоколом животных, утвержденной Кантональная администрации Базель-Штадт, Швейцария. Выполните все процедуры в стерильных условиях, где возможно. 1. Подготовка хирургии А…

Representative Results

В первом подходе C57BL / 6, были пересажены с IA BM12 аллотрансплантатами и IA б syngrafts. После удаления повязки, трансплантатов заметных признаков заживления ран без закрытия зоны контакта в мышей C57BL / 6 (фиг. 1а). После удаления повязки, клеточный воспаление CD4 + Т привело…

Discussion

Трансплантация кожи является широко используемым методом изучения неприятие и зависимость от Т-клеток терпимости. Так была создана модель пересадка кожи, несколько адаптации и изменения были применены. В описанной выше процедуре, IA BM12 трансплантации кожи хвоста осуществляется …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by SNF grants PPOOA-_119204 and PPOOP3_144918 to S.W.R. We thank E. Palmer and B.T.H. Hausmann for mice and technical expertise.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Betadine Standard solution Mundipharma
Cotton swab Carl Roth GmbH 31025060
Dafalgan , UPSA Bristol Myers Squibb SA
Hansaplast Finger Strips Beierdorf AG REF.76861
Histoacryl Tissue adhesive Braun REF.1050052
Leukotape classic , 2cm x 10 m BSN Medical SAS REF.02204-00
PBS, Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4 Invitrogen 10010015 GIBCO
Sterile gauze, 5 x 5cm, 8ply MaiMed GmbH 21010
Surgical instruments  FST 11003-12 Narrow pattern forceps, 
14095-11 Fine iris scissor curved,
14094-11 Fine iris scissor 
14010-15 Mayo scissors,
14080-11 Artery scissors ball tip 11.5 cm 
11021-14 Tissue forceps
Surgical Blade No.20 Swann-Morton LTD 3006 Carbon Steel
Surgical blade Handles Swann-Morton LTD
Syringe, 1ml ARTSANA disposable
Temgesic , Buprenorphine ESSEX Chemie AG 0.3mg/ml
Tissue Culture dishes 10 cm, 60.1 cm2 TPP
Vaseline Vifor SA
Warm pad Solis Type 223

Referencias

  1. Mahillo, B., Carmona, M., Álvarez, M., White, S., Noel, L., Matesanz, R. Global Data in Organ Donation and Transplantation. transplantation. 92 (10), 1069-1074 (2011).
  2. Halleck, F., et al. New perspectives of immunosuppression. Transplantation proceedings. 45 (3), 1224-1231 (2013).
  3. Wood, K. J., Bushell, A., Jones, N. D. Immunologic unresponsiveness to alloantigen in vivo. a role for regulatory T cells. Immunological reviews. 241 (1), 119-132 (2011).
  4. Sykes, M. Immune tolerance: mechanisms and application in clinical transplantation. Journal of Internal Medicine. 262 (3), 288-310 (2007).
  5. McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. Skin allograft rejection.. Current protocols in immunology. , (2009).
  6. McKenzie, I. F., Morgan, G. M., Sandrin, M. S., Michaelides, M. M., Melvold, R. W., Kohn, H. I. B6.C-H-2bm12. A new H-2 mutation in the I region in the mouse. The Journal of experimental medicine. 150 (6), 1323-1338 (1979).
  7. McIntyre, K. R., Seidman, J. G. Nucleotide sequence of mutant I-A beta bm12 gene is evidence for genetic exchange between mouse immune response genes. Nature. 308 (5959), 551-553 (1984).
  8. Stuart, P. M., Beck-Maier, B., Melvold, R. W. Provocation of skin graft rejection across murine class II differences by non–bone-marrow-derived cells. Transplantation. 37 (4), 393-396 (1984).
  9. Hausmann, B., Palmer, E. Positive selection through a motif in the alphabeta T cell receptor. Science. 281 (5378), 835-838 (1998).
  10. Bill, J., Ronchese, F., Germain, R. N., Palmer, E. The contribution of mutant amino acids to alloantigenicity. The Journal of experimental medicine. 170 (3), (1989).
  11. Monaco, A. P. Immunosuppression and tolerance for clinical organ allografts. Current Opinion in Immunology. 1 (6), 1174-1177 (1989).
  12. Rosenberg, A. S., Singer, A. Cellular basis of skin allograft rejection: an in vivo model of immune-mediated tissue destruction. Annual Review of Immunology. 10, 333-358 (1992).
  13. Kingsley, C. I., Nadig, S. N., Wood, K. J. Transplantation tolerance: lessons from experimental rodent models. Transplant international : official journal of the European Society for Organ Transplantation. 20 (10), 828-841 (2007).
  14. Larsen, C. P., et al. Long-term acceptance of skin and cardiac allografts after blocking CD40 and CD28 pathways. Nature. 381 (6581), 434-438 (1996).
  15. Tomura, M., Nakatani, I., Murachi, M., Tai, X. G., Toyo-oka, K., Fujiwara, H. Suppression of allograft responses induced by interleukin-6, which selectively modulates interferon-gamma but not interleukin-2 production. Transplantation. 64 (5), 757-763 (1997).
  16. Ring, G. H., et al. Interferon-gamma is necessary for initiating the acute rejection of major histocompatibility complex class II-disparate skin allografts. Transplantation. 67 (10), 1362-1365 (1999).
  17. Rosenberg, A. S., Finbloom, D. S., Maniero, T. G., Vander Meide, P. H., Singer, A. Specific prolongation of MHC class II disparate skin allografts by in vivo administration of anti-IFN-gamma monoclonal antibody. Journal of immunology. 144 (12), 4648-4650 (1950).
  18. Goes, N., Sims, T., Urmson, J., Vincent, D., Ramassar, V., Halloran, P. F. Disturbed MHC regulation in the IFN-gamma knockout mouse. Evidence for three states of MHC expression with distinct roles for IFN-gamma. Journal of immunology. 155 (10), 4559-4566 (1995).
  19. Surquin, M., et al. IL-4 deficiency prevents eosinophilic rejection and uncovers a role for neutrophils in the rejection of MHC class II disparate skin grafts. Transplantation. 80 (10), 1485-1492 (2005).
  20. Gaylo, A. E., Laux, K. S., Batzel, E. J., Berg, M. E., Field, K. A. Delayed rejection of MHC class II-disparate skin allografts in mice treated with farnesyltransferase inhibitors. Transplant immunology. 20 (3), 163-170 (2009).
  21. Bose, A., Inoue, Y., Kokko, K. E., Lakkis, F. G. Cutting edge: perforin down-regulates CD4 and CD8 T cell-mediated immune responses to a transplanted organ. Journal of immunology. 170 (4), 1611-1614 (2003).

Play Video

Citar este artículo
Schmaler, M., Broggi, M. A. S., Rossi, S. W. Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice. J. Vis. Exp. (89), e51724, doi:10.3791/51724 (2014).

View Video