زرع الجلد الذيل لدراسة خيفي CD4 T الردود الخليوي في الفئران
Summary
Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.
Abstract
The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention.
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-γ in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.
Introduction
زرع الأعضاء الصلبة مثل الجلد والقلب والكلى هو الآن إجراء القياسية في الممارسة الطبية في جميع أنحاء العالم 1. يمكن رفض الأعضاء المزروعة بنجاح من قبل تفعيل نظام المناعة المتلقي، الذي يعترف مستضدات التوافق النسيجي الرئيسي من الجهة المانحة. مرضى زرع بالتالي تحتاج إلى علاج بالأدوية المثبطة للمناعة 2. تأسست خيفي زرع الجلد في الفئران عن طريق مدور وزملاؤه في عام 1955، وكان مفيدا لتحديد الجزيئات المستهدفة وصفها لاحقا معقدة التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) الصف الأول والثاني. منذ ذلك الحين، تم زرع الجلد نموذج تعديل بشكل مستمر وتكييفها لدراسة دور مجموعات فرعية الخلايا T وأهمية الكيميائية والبيولوجية التدخل في قمع رفض الكسب غير المشروع 2-4. الجلد من الأذن والجذع هي أكثر صعوبة لإعداد وهم اكثر عرضة لنقص الأكسجة ونخر الجلد من الذيل 5؛ ومع ذلك،الإجراء هو زرع مماثلة. بالإضافة رصد الذيل زرع الجلد من السهل نظرا لنسيج الشعر سمة من الجلد.
توفر هذه المقالة إجراء مفصلة لفئة MHC II عدم تطابق زرع الذيل الجلد الذي يسمح لدراسة جوانب مختلفة من CD4 + T الخلية بوساطة رفض طعم خيفي والتسامح في الفئران. الطفرة ثلاث نقاط الطبيعي في MHC الدرجة الثانية IA جزيء ب (وتسمى IA bm12) 6-9 يكفي للحث على رفض المغايرة الجلد في C57BL / 6 الفئران 8. جزيء bm12 IA ينشط خلايا CD4 + T مع مختلف αβ-T الخلايا مستقبلات (TCR) سلاسل من C57BL / 6 الفئران، التي تم تحديدها بين الخلايا T-Vα2Vβ8 TCR محددة من أجل توليد ماوس TCR-10 المعدلة وراثيا. وقد استخدم نقل بالتبني من الخلايا T-Vα2Vβ8 TCR محددة لوضع نموذج الرفض في C57B العوز المناعيL / 6 Rag2 – / – الفئران زرعها مع IA bm12 الجلد.
الاختلافات الجينية بين المتبرع والمتلقي تؤثر على نتائج القبول والرفض زرع. هناك أنواع مختلفة من عمليات زرع: زرع طعم ذاتي هي من الفرد المتلقي نفسه؛ syngrafts والمغايرة هي من زرع الأفراد متطابقة وراثيا وجينيا لا علاقة لها على التوالي. وقد ثبت قبول مختلفة خيفي زرع الأعضاء من خلال التدخل الكيميائية والبيولوجية في المرضى ونماذج الماوس 11،3،4. في النهج الأساسي، أظهرت مكافحة CD3 المعالجة الضد C57BL / 6 الفئران البقاء على قيد الحياة لفترة طويلة من IA bm12 الذيل الجلد (بيانات غير منشورة). أدى استنزاف CD4 + و CD8 + T الخلايا قبل زرع في الفئران المتلقية في قبول MHC من الدرجة الأولى والثانية ترقيع غير متطابقة (القس في 12). ومن المثير للاهتمام، ورفض ترقيع الجلد يعتمد على وجود CD4 + </sup> خلايا T (القس في 12). في هذا النموذج، تستهدف تفاعلات معينة بين الخلايا المناعية المختلفة من خلال منع الجزيئات costimulatory مع الأجسام المضادة أو قمع مع الخلايا التائية التنظيمية قد تحفز التسامح (بيانات غير منشورة). في الواقع، ومنع كل من CD40 CD28 وأدى إلى طويلة الأجل طعم خيفي الجلد التسامح 13،14.
زرع الذيل الجلد هو سهلة لتنفيذ وسهلة لرصد مقارنة زرع الأعضاء الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، زرع الذيل الجلد هي سهلة التحضير وأقل عرضة لنقص التروية من أنسجة الجلد الأخرى. وعلى النقيض من حقن التخدير، واستخدام الغاز مخدر (isofluorane) خلال زرع يقصر كل من الإجراء والانتعاش مرة المستفيدة. الشباك من زرع الذيل الجلد، والتي قد تؤدي إلى عدم اكتمال التئام الجروح ورفض الكسب غير المشروع، ومنعه من خلال تطبيق لاصق الأنسجة. علاوة على ذلك، IA bm12 الذيل الجلد نموذج زرع ينشط حصرا CD4 <sup> + الخلايا التائية في كل مناعيا والفئران العوز المناعي (من نفس الخلفية الوراثية) تسهيل تفسير النتائج.
يصف هذا البروتوكول نموذج الفأر موثوق بها، واستنساخه رصدها بسهولة أن يسمح للتدخل الكيميائية والبيولوجية. ويهدف نموذج للتحقيق في الرفض والتسامح تحريض زرع الذيل الجلد.
Protocol
Representative Results
Discussion
زرع الجلد هو طريقة تستخدم على نطاق واسع لدراسة الرفض والتسامح تعتمد على خلايا تي. منذ تأسيس نموذج زرع الجلد، وطبقت العديد من التعديلات والتغييرات. في الإجراء وصفها، يتم تنفيذ IA bm12 زرع الذيل الجلد باستخدام الغاز مخدر (isofluorane). استخدام التخدير الغاز يقلل من وقت ال?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by SNF grants PPOOA-_119204 and PPOOP3_144918 to S.W.R. We thank E. Palmer and B.T.H. Hausmann for mice and technical expertise.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Betadine Standard solution | Mundipharma | ||
| Cotton swab | Carl Roth GmbH | 31025060 | |
| Dafalgan , UPSA | Bristol Myers Squibb SA | ||
| Hansaplast Finger Strips | Beierdorf AG | REF.76861 | |
| Histoacryl Tissue adhesive | Braun | REF.1050052 | |
| Leukotape classic , 2cm x 10 m | BSN Medical SAS | REF.02204-00 | |
| PBS, Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010015 | GIBCO |
| Sterile gauze, 5 x 5cm, 8ply | MaiMed GmbH | 21010 | |
| Surgical instruments | FST | 11003-12 | Narrow pattern forceps, |
| 14095-11 | Fine iris scissor curved, | ||
| 14094-11 | Fine iris scissor | ||
| 14010-15 | Mayo scissors, | ||
| 14080-11 | Artery scissors ball tip 11.5 cm | ||
| 11021-14 | Tissue forceps | ||
| Surgical Blade No.20 | Swann-Morton LTD | 3006 | Carbon Steel |
| Surgical blade Handles | Swann-Morton LTD | ||
| Syringe, 1ml | ARTSANA | disposable | |
| Temgesic , Buprenorphine | ESSEX Chemie AG | 0.3mg/ml | |
| Tissue Culture dishes 10 cm, 60.1 cm2 | TPP | ||
| Vaseline | Vifor SA | ||
| Warm pad | Solis | Type 223 |
Referencias
- Mahillo, B., Carmona, M., Álvarez, M., White, S., Noel, L., Matesanz, R. Global Data in Organ Donation and Transplantation. transplantation. 92 (10), 1069-1074 (2011).
- Halleck, F., et al. New perspectives of immunosuppression. Transplantation proceedings. 45 (3), 1224-1231 (2013).
- Wood, K. J., Bushell, A., Jones, N. D. Immunologic unresponsiveness to alloantigen in vivo. a role for regulatory T cells. Immunological reviews. 241 (1), 119-132 (2011).
- Sykes, M. Immune tolerance: mechanisms and application in clinical transplantation. Journal of Internal Medicine. 262 (3), 288-310 (2007).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. Skin allograft rejection.. Current protocols in immunology. , (2009).
- McKenzie, I. F., Morgan, G. M., Sandrin, M. S., Michaelides, M. M., Melvold, R. W., Kohn, H. I. B6.C-H-2bm12. A new H-2 mutation in the I region in the mouse. The Journal of experimental medicine. 150 (6), 1323-1338 (1979).
- McIntyre, K. R., Seidman, J. G. Nucleotide sequence of mutant I-A beta bm12 gene is evidence for genetic exchange between mouse immune response genes. Nature. 308 (5959), 551-553 (1984).
- Stuart, P. M., Beck-Maier, B., Melvold, R. W. Provocation of skin graft rejection across murine class II differences by non–bone-marrow-derived cells. Transplantation. 37 (4), 393-396 (1984).
- Hausmann, B., Palmer, E. Positive selection through a motif in the alphabeta T cell receptor. Science. 281 (5378), 835-838 (1998).
- Bill, J., Ronchese, F., Germain, R. N., Palmer, E. The contribution of mutant amino acids to alloantigenicity. The Journal of experimental medicine. 170 (3), (1989).
- Monaco, A. P. Immunosuppression and tolerance for clinical organ allografts. Current Opinion in Immunology. 1 (6), 1174-1177 (1989).
- Rosenberg, A. S., Singer, A. Cellular basis of skin allograft rejection: an in vivo model of immune-mediated tissue destruction. Annual Review of Immunology. 10, 333-358 (1992).
- Kingsley, C. I., Nadig, S. N., Wood, K. J. Transplantation tolerance: lessons from experimental rodent models. Transplant international : official journal of the European Society for Organ Transplantation. 20 (10), 828-841 (2007).
- Larsen, C. P., et al. Long-term acceptance of skin and cardiac allografts after blocking CD40 and CD28 pathways. Nature. 381 (6581), 434-438 (1996).
- Tomura, M., Nakatani, I., Murachi, M., Tai, X. G., Toyo-oka, K., Fujiwara, H. Suppression of allograft responses induced by interleukin-6, which selectively modulates interferon-gamma but not interleukin-2 production. Transplantation. 64 (5), 757-763 (1997).
- Ring, G. H., et al. Interferon-gamma is necessary for initiating the acute rejection of major histocompatibility complex class II-disparate skin allografts. Transplantation. 67 (10), 1362-1365 (1999).
- Rosenberg, A. S., Finbloom, D. S., Maniero, T. G., Vander Meide, P. H., Singer, A. Specific prolongation of MHC class II disparate skin allografts by in vivo administration of anti-IFN-gamma monoclonal antibody. Journal of immunology. 144 (12), 4648-4650 (1950).
- Goes, N., Sims, T., Urmson, J., Vincent, D., Ramassar, V., Halloran, P. F. Disturbed MHC regulation in the IFN-gamma knockout mouse. Evidence for three states of MHC expression with distinct roles for IFN-gamma. Journal of immunology. 155 (10), 4559-4566 (1995).
- Surquin, M., et al. IL-4 deficiency prevents eosinophilic rejection and uncovers a role for neutrophils in the rejection of MHC class II disparate skin grafts. Transplantation. 80 (10), 1485-1492 (2005).
- Gaylo, A. E., Laux, K. S., Batzel, E. J., Berg, M. E., Field, K. A. Delayed rejection of MHC class II-disparate skin allografts in mice treated with farnesyltransferase inhibitors. Transplant immunology. 20 (3), 163-170 (2009).
- Bose, A., Inoue, Y., Kokko, K. E., Lakkis, F. G. Cutting edge: perforin down-regulates CD4 and CD8 T cell-mediated immune responses to a transplanted organ. Journal of immunology. 170 (4), 1611-1614 (2003).
