Die hier beschriebene Fluoreszenz-basierten Calciummobilisierungsassay ist ein Medium-Durchsatz Rückwärts pharmakologischen Screening-System für die Identifizierung von funktionell aktivierenden Liganden (n) der Orphan-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs).
Seit mehr als 20 Jahren hat sich umgekehrter Pharmakologie war die herausragende Strategie, um die aktivierende Liganden von Orphan-G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) zu entdecken. Das Einsetzen eines Reverse Pharmakologie Assay ist die Klonierung und anschließende Transfektion eines GPCR von Interesse in einem zellulären Expressionssystem. Das heterologe exprimierten Rezeptor wird dann mit einer Verbindungsbibliothek von Kandidaten-Liganden in Frage, um die Rezeptor-aktivierende Ligand (en) zu identifizieren. Rezeptoraktivierung durch Messung der Veränderungen in der Konzentration des zweiten Botenreportermoleküle, wie Calcium-oder cAMP geprüft. Die hier beschriebene Fluoreszenz-basierten Calciummobilisierungsassay ist ein häufig verwendetes Medium-Durchsatz Rückwärts pharmakologischen Test. Der Orphan-GPCR wird vorübergehend in humanen embryonalen Nieren 293T (HEK293T-Zellen) exprimiert und ein Promiscuous Ga-16-Konstrukt kotransfiziert. Nach Ligandenbindung, die Aktivierung der G &agr;-Untereinheit 16 induziert die Freisetzung von Calcium-fROM Die endoplasmatischen Retikulum. Vor der Liganden-Screening werden die Rezeptor-exprimierenden Zellen mit einem fluoreszierenden Calciumindikator Fluo-4 Acetoxymethyl geladen. Das Fluoreszenzsignal von Fluo-4 vernachlässigbar ist in Zellen, die unter Ruhebedingungen, kann aber mehr als eine 100-fache bei der Wechselwirkung mit Calciumionen, die nach Rezeptoraktivierung freigesetzt werden, verstärkt werden. Das beschriebene Verfahren erfordert nicht die zeitaufwendige Errichtung von stabil transfizierten Zelllinien, in denen die transfizierte genetische Material in das Wirtszellgenom integriert. Stattdessen wird eine transiente Transfektion, Erzeugen temporärer Expression des Zielgens, ist ausreichend, um die Screening-Assay durchzuführen. Der Aufbau ermöglicht Mitteldurchsatz-Screening von Hunderten von Verbindungen. Co-Transfektion der Promiscuous G &agr; 16, die Paare zu den meisten GPCRs ermöglicht die intrazellulären Signalweges in Richtung der Freisetzung von Calcium umgeleitet werden, unabhängig von der nativen Signalweges der endogenen Pflastergen. Die HEK293T-Zellen sind leicht zu handhaben und haben ihre Wirksamkeit im Laufe der Jahre in deorphanization Rezeptor-Assays nachgewiesen. Jedoch kann die Optimierung des Assays für spezifische Rezeptoren notwendig bleiben.
G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) bilden eine der größten und vielfältigsten Familien unter allen Zelloberflächenproteine. Ihre Anwesenheit bei Wirbeltieren, Wirbellose, Pflanzen, Hefe und Schleimpilz, als auch in Protozoen und frühestens diploblastic Metazoa zeigt an, dass GPCRs gehören zu den ältesten Moleküle mit Signaltransduktion 1 verbunden. Ihre natürliche aktivierenden Liganden umfassen eine große Vielfalt von äußeren Reizen einschließlich Peptide, biogene Amine, Geruchsstoffe, Glykoproteine, 2 und Photonen. Als solche sind diese Rezeptor-Ligand-Signalsysteme in einer Vielzahl von physiologischen Prozessen beteiligt. Das breite Funktionsspektrum macht sie ideal für die Entwicklung von Therapeutika, die eine Vielzahl von Krankheiten des Menschen zu decken. Über 50-60% der aktuellen Drogenziele werden durch GPCRs 3,4 vertreten. Neben ihrer großen Bedeutung in der pharmazeutischen Industrie sind GPCRs auch im Rampenlicht für die Entwicklung einerneue Generation von Spezies-spezifische Insektizide und Pestizide 5,6 im Allgemeinen. Da die natürlichen Liganden von vielen GPCRs sind noch nicht identifiziert, werden sie als Waise GPCRs eingestuft. Die deorphanization dieser Rezeptoren wird das Verständnis der physiologischen Funktionen in Organismen zu verbessern und kann vermeintlichen Ziele für neue Arzneimittelanwendungen 7 aufzudecken.
Da die genomische Zeit wird die Rückwärts pharmakologischen Strategie häufig für die deorphanization von GPCRs 8 angelegt. Der Ansatz impliziert, dass ein Orphan-Rezeptor wird als "Haken" zu "Fisch aus" seiner aktivierenden Liganden aus einem biologischen Extrakt oder aus einer Bibliothek von synthetischen Verbindungen verwendet. Die GPCR von Interesse ist daher kloniert und anschließend in einem zellulären Expressionssystem transfiziert. In den am häufigsten verwendeten Verfahren wird die Rezeptoraktivierung durch Messung der Veränderungen in der Konzentration des zweiten Botenmoleküle bestimmt 9 </sup>. Die Haupt Rezeptor-Screening-Assays beruhen auf Calcium-sensitiven biolumineszierende Proteine (zB Aequorin) 10 oder fluoreszierenden Calcium-Indikatoren (z. B. Fluo-4) 11. Die Fluoreszenz-basierten Assays, in dem Rezeptor-exprimierenden Zellen mit einem Fluoreszenz-Calciumindikator vor der Liganden-Screening geladen wird, haben den Vorteil, dass sie ermöglichen Hochdurchsatz-Screening durch ihre einfache Bedienung, kurze Lesezeit und die Flexibilität des Screening mehrere Orphan-Rezeptoren auf einer einzigen Platte 12.
Hier wird die Fluoreszenz basierenden Assay Calciummobilisierung gründlich beschrieben und durch die deorphanization Verfahren der Drosophila melanogaster kurzen Neuropeptid F (sNPF)-Rezeptor dargestellt. Diese neuropeptidergic Signalsystem wurde ursprünglich von Mertens et al aus. 2002 13 mit einem Calcium-Biolumineszenz-Assays in chinesischen Hamstereierstock-(CHO)-Zellen durchgeführt,14 und von Feng et al. Im Jahr 2003 mit einer elektrophysiologischen Test unter Verwendung von Xenopus Oozyten 15. Die Anwesenheit des sNPF Signalisierungssystem scheint der zu dem Stamm der Arthropoda, wo es in einer Vielzahl von Verfahren, einschließlich der Regulierung der Zufuhr, des Wachstums, Stressreaktionen, Fortbewegung, und zirkadiane Rhythmen beteiligt 16 begrenzt.
Forschung an neuropeptidergic Signalsysteme bei Insekten nicht nur auf neue Ziele für die Entwicklung von Insektiziden führen, aber das Wissen um ihre Funktion kann auch auf andere Organismen wie viele Signalsysteme sind in der Regel gut im Laufe der Evolution konserviert 17 hochgerechnet werden. In den letzten zehn Jahren große Fortschritte in der deorphanization Prozess der Insektenneuropeptid GPCRs gemacht worden. Trotz dieser Bemühungen haben nur eine geringe Anzahl von Rezeptoren auf ihrer zugehörigen Liganden abgestimmt und Lasten der Sequenzinformation fürneuen Orphan-GPCRs hat sich aufgrund der boomenden Genomik 18 zur Verfügung. Die Verfügbarkeit der Mittel / Hochdurchsatz-Screening-Methoden, wie die Fluoreszenz-basierten Assays Calcium-Mobilisierung, die sich als ein weithin angewandte Technik 9,18 zu können, ist daher von unschätzbarem Wert.
Die Fluoreszenz-basierte Calciummobilisierungsassay, wie hier beschrieben wird in der menschlichen embryonalen Nieren 293T (HEK293T-Zelllinie) durchgeführt und verwendet eine fluoreszierende Sonde, um Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration auf die Rezeptoraktivierung zu bestimmen. Um hohe Expressionsniveaus und Translation der Rezeptor zu garantieren, wird eine Kozak-Consensus-Sequenz 19 an das 5'-Ende des Rezeptor-kodierende Sequenz, die anschließend in einen Expressionsvektor (z. B. pcDNA Vektorreihe für Säugerzelllinien) kloniert zugegeben. Da es schwierig ist, die endogenen G-Protein-Kopplung eines verwaisten GPCR basierend auf Sequenzinformation vorherAllein die Second-Messenger-Moleküle (z. B. Calcium-oder cAMP), die nach Rezeptoraktivierung moduliert werden, bleiben oft unbekannt vor Ligand Identifikation. Um dieses Problem zu umgehen, Promiskuität G-Proteine der G q-Familie (zB Maus-Ga-Ga-15 oder Menschen 16 verwendet [hier]) oder chimäre G-Proteine (zB Ga-qi5), die mit den meisten GPCRs interagieren und induzieren die Freisetzung von Kalzium kann coexprimiert 20,21,22 werden. Bei Bindung des Liganden an seinen Rezeptor, der GPCR eine Konformationsänderung, die die Aktivierung von spezifischen intrazellulären Signalwege führt. Die Guanosindiphosphat (BIP)-Molekül, unter Ruhebedingungen zu dem Ga-16-Untereinheit gebunden ist, wird von einem Guanosin-Triphosphat (GTP)-Molekül ersetzt werden. Dies provoziert die Dissoziation des heterotrimeren G-Proteins in einer G &agr; 16 und Gβγ-Untereinheit. Die Ga-16-Untereinheit aktiviert Phospholipase C &# 946; (PLC &bgr;), die wiederum hydrolysiert das membrangebundene Phosphatidylinositol-bisphosphat (PIP 2), was zu Diacylglycerol (DAG) und Inositol-Triphosphat (IP 3). IP 3 wird während der gesamten Cytoplasma verteilt und aktiviert IP 3-abhängigen Calcium in der Membran des endoplasmatischen Retikulums, die die Freisetzung von Calcium in das Zytoplasma induziert vorhandenen Kanäle.
Die Calcium-Freisetzung auf Rezeptor-Aktivierung erfolgt innerhalb von Sekunden und kann durch Laden von Zellen vor der Screening-Test mit einem Calcium-sensitiven Farbstoff, wie Fluo-4 acetoxymethyl (AM) 11 erfasst werden. Die AM-Ester-Gruppe ermöglicht die Fluorophore, die Zellmembran zu durchqueren und wird durch zytoplasmatische Esterasen einmal im Inneren der Zelle gespalten. Folglich werden die negativen Ladungen der Fluoreszenzfarbstoff demaskiert, diffundiert aus der Zelle und ermöglicht es, mit Calciumionen in Wechselwirkung verhindert. Das Fluoreszenzsignal of Fluo-4 ist unter Ruhebedingungen nur Calciumkonzentrationen enthalten, im nanomolaren Bereich vernachlässigbar in den Zellen. Wenn jedoch Calcium auf die Rezeptoraktivierung freigesetzt wird, kann das Signal konzentrationsabhängig auf mehr als das 100fache zu erhöhen, hierdurch gewährleistet ein großes Signal-zu-Rausch-Verhältnis. Fluo-4 zeigt auch einen großen Dynamikbereich für die Meldung [Kalzium] um einen K d (Calcium) von 345 nM, so dass es geeignet, physiologisch relevanten Kalzium Änderungen in einer Vielzahl von Zellen zu messen. Die Anregung von Fluo-4 tritt bei 488 nm und die Emissionsfluoreszenz bei 525 nm 11 gemessen. Fluorimetern wie die Fluoreszenz-Imaging-Plattenlesegerät (FLIPR) 23, der Novostar oder der Flexstation (Station-Gerät) 12 Medium / High-Throughput-Systeme, die gleichzeitige Verbindung Addition und die Erfassung der Fluo-4-Rezeptor-Signal bei Aktivierung für jeden gut zu ermöglichen in einer Testplatte. Die hier beschriebene Calcium-Mobilisierung Assay beruht auf der StationGerät 96-Well-Mikroplatten-System.
Die SoftMax Pro-Software (Software) wird verwendet, um die Station Einrichtung sowie für die Datenanalyse zu betreiben. Das Programm zeigt sofort die Ergebnisse als Grafiken in 96-Well-Format. Mehrere Vertiefungen gleichzeitig ausgewählt, um das Ergebnis dieser Vertiefungen auf derselben Grafik zu vergleichen. Die relative Fluoreszenzeinheit (RFU) Werte von Vertiefungen in jeder Spalte gleichzeitig für einen Zeitraum von zwei Minuten gemessen, beginnend vor der Zugabe der Verbindungen zu den Vertiefungen und weiterhin nach der Messung des Fluoreszenzsignals nach Rezeptoraktivierung. Typischerweise ist die Tendenz eines Agonisten Kurve ausgerichtet ist, bis die Grundlinie eine aktivierende Verbindung zu den Zellen zugegeben, was zu einem raschen Anstieg des Fluoreszenzsignals. Die Peakhöhe wird mit der endgültigen Konzentration des Agonisten in der gut korreliert. Nach dem Höhepunkt, fällt das Fluoreszenzsignal langsam in Richtung der Grundlinie Niveau. Die RFU Messungen ca.n in Konzentrations-Wirkungs-Kurven umgewandelt, um den EC 50-Wert (halbmaximale effektive Konzentration) eines Liganden zu bestimmen. Im Allgemeinen mindestens drei unabhängigen Bildschirmen, die jeweils drei Replikate einer Konzentrationsreihe, durchgeführt werden sollte, um eine zuverlässige Konzentrationsantwortkurve zu komponieren.
Es wird empfohlen, mehrere positive und negative Kontrollen in der Versuchsanordnung umfassen. Erstens, eine Transfektion Steuerung, dh die Umsetzung eines Rezeptors mit einem bekannten Liganden getestet werden. Dies ermöglicht die Überprüfung, ob das Transfektionsmittel Betrieb war. Einbau von einem Kontrollexperiment mit einem Agonisten für einen endogenen Rezeptor der Zelllinie und einer Negativkontrolle (z. B. Waschpuffer) werden ebenfalls empfohlen, um die Gesundheit und Lebensfähigkeit der Zellen zu überwachen und die Möglichkeit, dass der Waschpuffer wurde mit kontaminierten auszuschließen ein Faktor, der eine Auto-fluore entlocken konnteDuft Antwort. Häufigsten verwendeten Agonisten sind ein Peptid, das von der Protease-aktivierte Rezeptor 1 (PAR-1), die als eine PAR 1-selektiven Agonisten oder Carbachol, die die Acetylcholin-Rezeptor aktiviert wirkt abgeleitet. Zellen, die mit einem leeren Expressionsvektor transfiziert sollten auch getestet werden, um auszuschließen, dass Wirkstoffe interagieren mit endogenen Rezeptoren der Zelle. Optimierung von mehreren in der unten beschriebenen Protokoll-Parameter für unterschiedliche Signalsysteme erforderlich. Eine schematische Abbildung der gesamten Fluoreszenz basierenden Calciummobilisierungsassay ist in Abbildung 1 dargestellt.
Abbildung 1. Insgesamt Schema der Fluoreszenz-basierten Assays Calcium-Mobilisierung. Automatisierte Liquid Handling und gleichzeitigen Fluoreszenzmessungen werden mit der Station durchgeführtMikroplatten-Lesegerät, von der Software angesteuert. Die Station Gerät enthält drei Schubladen: eine für die Zellplatte, Verbundplatte und Spitze Rack. Die build-in-Pipette Transfers Verbindungen, die aus einer Spalte der Verbindung Platte an die entsprechende Spalte der Zelle Platte (Schritt 1). Jede Vertiefung der Zellplatte enthält eine Monolage von HEK293T-Zellen, die mit dem GPCR von Interesse und den Promiscuous Ga-16-Untereinheit co-transfiziert wurden. Wenn eine Verbindung, die den Rezeptor aktiviert, wird die Ga-16-BIP gebunden durch GTP ersetzt. Die G &agr;-Untereinheit 16 anschließend dissoziiert von der Gβγ-Komplex und aktiviert Phospholipase C &bgr; (PLC &bgr;), die wiederum hydrolysiert Phosphatidylinositol bisphosphat (PIP 2), was zu Diacylglycerol (DAG) und Inositol-Triphosphat (IP 3). IP 3 aktiviert IP 3-abhängigen Calcium in der Membran des endoplasmatischen Reticulums Kanälen induzieren die Freisetzung von Calcium into das Zytoplasma. Die Wechselwirkung von Kalzium mit Fluo-4 (bei dem die Zellen vor der Zugabe Verbindung geladen ist) führt zu einem Fluoreszenzsignal (Schritt 2). Die Software stellt die Ergebnisse als relative Fluoreszenzeinheit-Werte (RFU) in Abhängigkeit von der Zeit, und die Peakhöhen korreliert mit der Ligandenkonzentration in einer konzentrationsabhängigen Weise. Diese Daten können dann in einer Konzentration-Antwort-Kurve umgewandelt, um den EC 50-Wert eines Ligand-Rezeptor-Paares (Schritt 3) zu bestimmen.
Die Fluoreszenz-basierte Calciummobilisierungsassay wurde erfolgreich angewendet, um die funktionelle Charakterisierung des Drosophila sNPF peptidergen Signalisierungssystem, das bereits von Mertens et al wurde bestätigt. mit einem Biolumineszenz-Assay und von Feng et al. mit einer elektrophysiologischen Assay 13,15. Die EC 50-Werte mit der Fluoreszenz-Assay in HEK293T-Zellen erhalten werden, sind etwa 10-mal weniger als die mit dem Biolumineszenz-Assay in CHO-Zellen (Drome-sNPF-1 durchgeführt, erhalten: fluo = 2.04 nM, Leuchten = 51 nM; Drome-sNPF- 2: Fluo = 5,89 nM, Leuchten = 42 nM; Drome-sNPF-3: fluo = 5,55 nM, Leuchten = 31 nM; Drome-sNPF-4: fluo = 0,50 nM, Leuchten = 75 nM). Diese Variationen können durch verschiedene Faktoren, einschließlich der Tatsache, daß eine der verwendeten Expressionssysteme können für die funktionelle Expression eines bestimmten Rezeptors besser geeignet sein, oder die Faltung des bestimmten Rezeptoren in c weniger effizient erklärtertain Zelltypen. Die EC 50-Werte von allen vier Drome sNPF-Peptide sind im nanomolaren Bereich, wenn auf ihren Rezeptor getestet sowohl mit dem Fluoreszenz-und Biolumineszenz-Assay, im allgemeinen die Unterstützung der physiologischen Relevanz der Peptid-Rezeptor-Interaktion in vivo.
Beachten Sie, dass keine Kontrolle der Transfektion mit einem Rezeptor, für die die aktivierende Liganden ist bekannt, wurde in der hier vorgestellten Bildschirm enthalten, da die Drosophila sNPF Signalsystem ist in der Regel der Steuer Transfektion in Versuchsaufbauten. Die positive Kontrolle mit einem endogenen Liganden der HEK293T-Zellen (PAR-1) und die Negativkontrolle (Waschpuffer) wurden in dem Bildschirm enthalten. Die Ergebnisse der PAR 1 zeigte, dass die Zellen in einem guten Zustand. Die Negativkontrolle (Waschpuffer) nicht ein Fluoreszenzsignal zu entlocken, was darauf hindeutet, dass das Medium, in dem die Peptide gelöst sind, war frei von Verunreinigungen, die inf könnteluence die Ergebnisse.
Die zuvor gekennzeichnet Drosophila sNPF Signalsystem wurde hier verwendet, um die Fluoreszenz-basierten Assays Kalziummobilisierung zu erklären. Zu diesem Zweck wurden Konzentrationsreihen der aktivierenden Liganden sofort getestet. Wenn jedoch ein Orphan-Rezeptor ist mit Überexpression in einem Screening-Test, um eine Bibliothek mit Hunderten von Verbindungen zu testen gebracht, es zum ersten Bildschirm mit einer relativ hohen Endkonzentrationen der Liganden (z. B.., 10 oder 1 &mgr; M) empfohlen wird. Nach der Detektion eines Aktivierungsverbindung kann eine Verdünnungsreihe dieser Verbindung, um eine Konzentrationsantwortkurve zusammenzustellen und um den EC 50-Wert zu bestimmen, untersucht werden.
Sobald die Aktivierungsliganden eines Rezeptors bestimmt wird, kann die intrazelluläre Signalwegs durch die Anpassung des Protokolls untersucht werden. Der Assay kann wie oben beschrieben, aber ohne Co-Transfektion des G ^5, 16-Untereinheit. Wenn ein Calcium-Reaktion gemessen wird, bedeutet dies, dass die Rezeptor-Paare mit einem endogenen G &agr; q-Untereinheit des zellulären Expressionssystem. Wenn kein Fluoreszenzsignal beobachtet wird, kann Protokolle Änderungen der Konzentration anderer sekundärer Botenstoffe (z. B.., CAMP) Messung angewendet werden.
Struktur-Aktivitäts-Beziehung (SAR)-Studien können durchgeführt werden, um Kernsequenz des Peptids für die Rezeptoraktivierung notwendig zu definieren. Zunächst werden trunkierte Sequenzen bewertet, um die minimale Aminosäuresequenz des Peptids, die noch in der Lage ist, den Rezeptor zu aktivieren, zu definieren. Weiter können Peptide getestet werden, bei dem systematisch jede Aminosäure für einen Alanin-Rest ersetzt wurde. Testen synthetischen Alanin-Substitutionsreihe auf dem Rezeptor ermöglicht, die Bedeutung von jeder der Aminosäuren für die Rezeptoraktivierung 24,25 bestimmen.
Trotz der häufigen Verwendung und bewährte Effizienzsamkeit, ist zu betonen, dass die hier beschriebene Assay müssen einige Anpassungen, um optimale Ergebnisse für spezifische Rezeptoren von Interesse zu gewinnen. Die Ga-16-Untereinheit hat den Vorteil, dass es für die meisten GPCRs bindet, kann aber auch eine dominant-negative Wirkung auf Rezeptoren haben, die endogen Paar über Ga-22 q. In diesem Fall kann es nützlich sein, verschiedene Kombinationen von G-Proteinen während der Optimierung eines neuartigen Calcium-Assay getestet und die Ergebnisse für G &agr; q-gekoppelten Rezeptoren in Abwesenheit oder Anwesenheit von G &agr; 16 zu vergleichen. Alternative Assays, die unabhängig von der G-Protein interagieren, um die Rezeptoraktivierung zu detektieren sind, können ebenfalls durchgeführt werden, wie die Translokation von GFP-markiertem Arrestin oder den Nachweis von Änderungen des Membranpotentials (z. B.. Durch FLIPR Membrane Potential Assay Kit). Neben der Fluo-04.00 hier verwendet wird, eine breite Palette von anderen Calcium-sensitiven Fluorophoren, jede mit ihrer eigenen spektralen und chemical Eigenschaften zur Verfügung. Die am besten geeigneten Fluorophor auf der Basis des GPCR, Zelltyp und der zur Verfügung stehenden Plattenlesegerät ausgewählt werden, aber experimentelle Verifikation erforderlich ist. Die Mengen der transfizierten DNA und der DNA / Transfektionsreagenz Verhältnis Notwendigkeit, für jeden Rezeptor-Transfektionsreagenz-Zelllinie Kombination bestimmt werden. Schließlich sollte beachtet werden, dass die Zellen in einer kontinuierlichen Kultur erlauben nur 20-25 verwendbar Passagen, die Screening-Assays durchzuführen.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren erkennen die Research Foundation Flanders (FWO-Vlaanderen, Belgien, G.0601.11) und der KU Leuven Research Foundation GOA/11/002. IB, TJ und LT profitieren von einem Stipendium der FWO-Vlaanderen.
HEK293T cells | |||
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Trypsin-EDTA solution (0.25%) | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | MP Biomedicals | 195173 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
Penicillin-Streptomycin (P-S) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
jetPRIME | Polyplus transfection | 114-01 | FuGENE HD Transfection Reagent (Promega); Lipofectamine LTX & Plus Reagent (Life technologies) |
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0392 | |
Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
Reagent A100, Lysis buffer | Chemometec | 910-0003 | |
Reagent B, Stabilizing buffer | Chemometec | 910-0002 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
HBSS buffer: Hank's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H8264 | |
Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
NaOH (1 M) | Vel | 2781 | |
Pluronic acid | Invitrogen | P-3000MP | |
Dimethyl-sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Calcium Green-1,.. (Invitorgen) |
TPP tissue culture flasks (T-75 and T-150) | Sigma-Aldrich | Z707503 and Z707554 | |
FlexStation device | Molecular Devices | NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Molecular Devices) | |
Black-walled polystyrene plates (96 wells) with clear bottom | Greiner Bio-One | 655090 | Corning 96 well flat clear bottom black polystyrene poly-D-lysine coated microplates |
NucleoCassette | Chemometec | 941-0001 | |
NucleoCounter NC-100 | Chemometec | ||
Microcentrifuge tubes, siliconized | BioCision | BCS-2470 | |
Polystyrene V-shaped 96-well plates | Greiner Bio-One | 651101 | |
96-Well, FlexStation Pipet Tips | Molecular Devices | 9000-0912 | |
Soft Max Pro software | Molecular Devices |