Faj-görüntülenen Sentetik Antikor Kütüphaneler itibaren Ölçeklenebilir Yüksek Verim Seçimi
Summary
Bir yöntem olup, aynı anda antijenlere karşı yüz Faj gösterimli birleştirici sentetik antikor kütüphanelerinden, ölçeklenebilir, yüksek verimli seçimleri yürütmek için görsel eşliğinde tarif edilmektedir. Bu paralel yaklaşımı kullanarak, standart bağışıklık tahlillerinde işlevsel çeşitli antijenler için yüksek bir çekim ve özelliğe gösteren antikor fragmanları izole ettik.
Abstract
hem temel hem de klinik araştırma uygulamaları ihtiyaçlarını karşılamak antikorlar için talep yüksek olduğu ve dramatik gelecekte artacak. Ancak, geleneksel monoklonal teknolojileri bu göreve kadar yalnız olmadıklarını açıktır. Bu proteom tüm erişilebilir elemanlarına yüksek kalite ve yenilenebilir afinite reaktifler için talebi karşılamak için alternatif yöntemlerin geliştirilmesine yol açmıştır. Bu amaç doğrultusunda, faj-görüntülenen sentetik antikor kütüphanelerinden seçimleri yürütmek için yüksek kapasiteli yöntemleri farklı antijenleri içeren uygulamalar için geliştirilmiştir ve hızlı verim ve başarı için optimize edilmiş. Burada, bir protokol video gösterimi ile bir kılavuzu 96 kanal sıvı tutucu veya otomatik robot sistemi kullanarak hedefleri yüzlerce karşı yüksek çeşitlilik kütüphanelerinden Fab faj klonlarının paralel seçimi göstermektedir ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. Bu protokol kullanılarak, tek bir kullanıcı antijenlerin yüzlerce oluşturmak,Paralel onlara antikorları seçmek ve 6-8 hafta içinde antikor bağlanmasını doğrulamak. Vurgulanan şunlardır: i) uygulanabilir bir antijen biçimi, ii) ön seçim antijen karakterizasyonu, iii) kritik özel ve yüksek afinite klonlarının seçimi etkileyen adımlar, ve iv) izleme seçim etkinliği ve erken evre antikor klon karakterizasyonu yolları. Bu yaklaşım ile, tek geçişli membran reseptörleri salgılanmış protein hormonları, ve çoklu alan hücre içi proteinler de dahil olmak üzere pek çok hedef sınıflarına sentetik antikor fragmanları (Fab'lar) elde edilmiştir. Bu fragmanlar, tam uzunluktaki antikorlar dönüştürülür ve yüksek bir çekim ve özelliğe arzettiği doğrulanmıştır. Dahası, Western blotting, ELISA, hücresel bağışıklık, immüno-çökeltme ve ilgili deneyler de dahil olmak üzere, standart bağışıklık tahlilleri, çeşitli işlevsel olduğu gösterilmiştir. Bu metodoloji antikor keşif hızlandırmak ve sonuçta amaç o hayata yakın bize getirecekf proteomu yenilenebilir, yüksek kaliteli antikorlar üreten.
Introduction
Post-genomik yaş başlaması ile karakterize ve proteinleri modüle kaliteli bağlayıcı reaktif durumu, yeni araştırma ve tedavi yollar açmak için esastır. Antikorlar, temel araştırma ve teşhis araçları ve potansiyel terapötik olarak hem akademik hem de endüstriyel araştırmacılara önemli olmaya devam etmektedir. Değil şaşırtıcı, özel antikorlar üretmek için geleneksel hibridoma teknolojileri güvenmek çoğu sözleşme antikor geliştirme firmaları, etkileyici bir büyüme olmuştur. Bununla birlikte, faj-görüntülenen antikor kütüphaneleri kullanılarak in vitro seçimi geleneksel teknolojiler sınırlamalar 1, 2 yüz benzersiz avantajlar ve başarı sunabilir güçlü bir alternatif teknoloji haline geliyor.
Araştırma araçları, üretmek için iki temel sorunlar olarak yüksek kaliteli antikorlar için önemli talep ışığında yenilenebilir antikorlar 1) Seçim çıktı ve 2) antijen av vardırailability. Grupların bir dizi şimdi verim ve antikor tanımlama oranını artırmaya yönelik in vitro seçim boru hatları tarif var. Bu açıklamalar detay tam uzunlukta ya üzerine seçerek dahil canlı yaklaşımların çeşitli kullanarak, 3,4 hedefler, veya yapısal etki 5,6,7 ilgili ya boncuk-tabanlı 6,8 veya 3,4 antijen immobilizasyon düzenleri tabanlı plaka. Buna ek olarak, gen sentezi teknolojileri 9 artan kabul maliyet etkin ve potansiyel olarak saflaştırılmış, tam uzunlukta antijenin yeterli miktarlarda elde etmede güçlükle hafifletmek, özellikle izole edilmiş alanlarının sistematik antijen üretimi yaptı. Tandem iki teknolojiyi kullanarak, kendi kendine yeten ve ölçeklenebilir antijen üretimi ve antikor seçimi boru hattı dile antijen alanların büyük kümeleri için antikorların paralel izolasyonunu sağlamak ve cha için reaktiflerin gelişimi kolaylaştırmak olacağını icat edildiyapısal ve işlevsel olarak ilgili proteinlerin bütün sınıfları racterizing.
Bu amaçla, eksprese antijen etki gen sentezi, antijenler ve ölçeklenebilir faj gösterimli antikor seçimleri yüksek verimlilik bakteriyel ifade silico tanımlanmasında çiftler geliştirilmiştir entegre bir boru hattı doğru. Bu boru hattı (lisans veya malzeme transferi anlaşması ile giderek mevcut antikor kütüphaneleri dahil) en yaşam bilimleri laboratuvarlarının mevcut sadece temel altyapı gerektirir, ama aynı zamanda bir endüstriyel ölçekte kullanım için otomasyona müsait. Bu protokol kullanılarak, afinite-etiketli antijen etki yüzlerce üretmek mümkündür ve rutin olarak bu antijenlerin çoğu son derece spesifik antikor fragmanları izole eder.
Faj ekran teknolojisi Fab, scFv ve özerk Fv etki ve a içeren rekombinant afinite reaktif biçimleri çok çeşitli gösterdi uyumluluk göstermiştirküçük 'alternatif çerçeveler' (tasarlanmış ankirin tekrar proteinleri (DARPINS), fibronektin (Fn), lipokalin etki ve daha 10) artan dizi. Bu yöntemler, kütüphanelerin diğer tiplerine adapte edilebilir kabul edilir, ancak Tartışma, antikorun ve antijenin Fab fragmanlarının izolasyonu için bu örnekteki sınırlıdır. Bu teknolojiyi kullanarak, küçük düşük nanomolar afinite ile Fab'ler, tam boy bir protein bağlama ve bağışıklık gibi bağışıklık tahlillerinde işlevsel olan birçok RNA bağlayıcı proteinler ve diğer başarılı seçilmiştir transkripsiyon faktör etki, SH2 etki alanları, de dahil olmak üzere protein alanlarının etiketli , immunopresipitasyon ve immunohistokimyasal. Önemlisi, rekombinant bağlayıcı klonlar tamamen yenilenebilir ve ifadeden yeniden üretilebilir ve böylece titiz klon doğrulama gider haklı, bakteriyel üretim sunan artan tutarlılık, tekrarlanabilirlik ve maliyet-etkililik yoluyla oluşturur.
Bu prot olarakocol ve eşlik eden video, immobilize edilmiş antijen sahaları kullanılarak faj görüntülemeli kütüphanelerinden antikor seçimi için temel yöntem gösterilmektedir. Diğer etiketler 11,12,13 ve seçim formatları da başarılı bir şekilde kullanılmıştır 13,14,2 rağmen, bu özel bir yöntem olup, mikro plakalar içinde pasif adsorpsiyonla da immobilize edilmiş GST-etiketli protein etki kullanmaktadır. Belirlenmesi ve doğrulama için özel zenginleştirilmiş klonal antikorlar izole yönelik seçim parametreleri paralel izleme seçimleri kurulumu ve yürütülmesi için kritik hususlar ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vitro antikor seçimleri yapılırken, seçim başarısı iki temel belirleyicileri üzerine seçilmesi için) iyi katlanmış antijenik hedefler izolasyon 1 ve 2) yüksek fonksiyonel çeşitlilik antikor kütüphanesinin fırsat. Bir çok durumda, iyi bir şekilde katlanmış, tam-boy proteinin yeterli miktarda bulunması sınırlayıcı olabilir. Bu sınırlamayı aşmak için bir yaklaşım, uygun bir afinite etiketine sahip bir bakteriyel ekspresyon vektörü içine sokulması için biyoinformat…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz NIH Ortak Fonu kabul etmek istiyorum – Protein Yakalama Reaktifler Programı Rekombinant Antikor Ağ antikor seçimi ve karakterizasyonu boru hattı ve robotik seçim platformunun finansman alımı için Yenilik Kanada Vakfı gelişimini finansmanı için.
Materials
| MATERIALS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system | Anachem Ltd | LIQ-96-200 | |
| Microplate shaker | VWR | 12620-926 | |
| ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge | Thermo Product | 75004525 | |
| ELx405 Select Deep Well Microplate Washer | Biotek | ELX405USD | |
| Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot | S&P Robotics | ||
| Plastic conical Falcon tube: 50 mL | VWR | 21008-178 | |
| Plastic conical Falcon tube: 15 mL | VWR | 89039-668 | |
| Axygen 1.7 mL microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-L-C | |
| 96-well/384-well Maxisorp plate | Sigma | M9410-1CS | |
| Corning 96-well V-bottom deep-well block | Corning | 3960 | |
| Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box | Corning | AXY-MTS-06-C-R-S | |
| Breathable adhesive plate sealing film | VWR | 60941-084 | |
| REAGENTS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| polyethylene glycol | Bioshop | PEG800.1 | |
| yeast extract | Bioshop | YEX401.1 | |
| bio-tryptone | Bioshop | TRP402.1 | |
| N-Z amine | Sigma | C7290 | |
| glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| lactose | Bioshop | LAC234 | |
| glycerol | Bioshop | GLY001.500 | |
| carbenicillin | Bioshop | CAR544.10 | |
| kanamycin | Bioshop | KAN201.25 | |
| tetracycline | Bioshop | TET701.25 | |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510.500 | |
| monobasic potassium phophate | Bioshop | PPM302.1 | |
| dibasic sodium phosphate | Anachemia | 84486-440 | |
| sodium chloride | Bioshop | SOD001.10 | |
| potassium chloride | Bioshop | POC308.1 | |
| calcium chloride | Bioshop | CCL302.500 | |
| magnesium sulphate | EMD | MX0070-1 | |
| magnesium chloride | Bioshop | MAG510.500 | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-1KG | |
| Na2SO4 | Bioshop | SOS513.500 | |
| agar | Bioshop | AGR001.500 | |
| SybrSafe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| phosphoric acid | Acros Organics | 201140010 | |
| lysozyme | Bioshop | LYS702.25 | |
| benzonase | Novagen | 71205 | |
| Triton X-100 | Bioshop | TRX506.500 | |
| protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Ni-NTA resin | Qiagen | 1018240 | |
| 1000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per mL) | NEB | N0315S | |
| HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP). | GE Healthcare | 27-9241-01 | |
| TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H2O2 peroxidase substrate | KPL | 50-76-00 | |
| dNTPs | Biobasic | DD0056 | |
| Taq polymerase | Genscript | E00007 | |
| Exonuclease | GE Healthcare | EZ0073X-EZ | |
| Shrimp alkaline phosphatase | GE Healthcare | E70092Z-EZ | |
Referencias
- Winter, G., Milstein, C. Man-made antibodies. Nature. 349, 293-299 (1991).
- Miersch, S., Sidhu, S. S. Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations. Methods. 57, 486-498 (2012).
- Schofield, D. J., et al. Application of phage display to high throughput antibody generation and characterization. Genome Biol. 8, R254 (2007).
- Hust, M., et al. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. J. Biotechnol. 152, 159-170 (2011).
- Colwill, K., Graslund, S. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat. Methods. 8, 551-558 (2011).
- Mersmann, M., et al. Towards proteome scale antibody selections using phage display. Nat. Biotechnol. 27, 118-128 (2010).
- Pershad, K., et al. Generating a panel of highly specific antibodies to 20 human SH2 domains by phage display. Protein Eng. Des. Sel. 23, 279-288 (2010).
- Turunen, L., Takkinen, K., Soderlund, H., Pulli, T. Automated panning and screening procedure on microplates for antibody generation from phage display libraries. J Biomol. Screen. 14, 282-293 (2009).
- Hughes, R. A., Miklos, A. E., Ellington, A. D. Gene synthesis: methods and applications. Methods Enzymol. 498, 277-309 (2011).
- Boersma, Y. L., Pluckthun, A. DARPins and other repeat protein scaffolds: advances in engineering and applications. 22, 849-857 (2011).
- Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533 (2003).
- Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
- Fellouse, F. A., et al. High-throughput generation of synthetic antibodies from highly functional minimalist phage-displayed libraries. J. Mol. Biol. 373, 924-940 (2007).
- Paduch, M., et al. Generating conformation-specific synthetic antibodies to trap proteins in selected functional states. Methods. 60, 3-14 (2013).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41, 207-234 (2005).
- Huang, H., Sidhu, S. S. Studying binding specificities of peptide recognition modules by high-throughput phage display selections. Methods Mol. Biol. 781, 87-97 (2011).
- McLaughlin, M. E., Sidhu, S. S. Engineering and analysis of peptide-recognition domain specificities by phage display and deep Sequencing. Methods Enzymol. 523, 327-349 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- den Engelsman, J., et al. Strategies for the assessment of protein aggregates in pharmaceutical biotech product development. Pharm. Res. 28, 920-933 (2011).
- Lavinder, J. J., Hari, S. B., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. High-throughput thermal scanning: a general, rapid dye-binding thermal shift screen for protein engineering. J. Am. Chem. Soc. 131, 3794-3795 (2009).
- Fellouse, F. A., Sidhu, S. S., Howard, G. C., MR, K. a. s. e. r. . Making antibodies in bacteria. in Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , 151-172 (2013).
- Acton, T. B., et al. Preparation of protein samples for NMR structure, function, and small-molecule screening studies. Methods in Enzymology. 483, 23-47 (2011).
- Mahon, C. M., et al. Comprehensive interrogation of a minimalist synthetic CDR-H3 library and its ability to generate antibodies with therapeutic potential. J. Mol. Biol. 425, 1712-1730 (2013).
- Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J. Mol. Biol. 425, 803-811 (2013).
- Bradbury, A. R., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nat. Biotechnol. 29, 245-254 (2011).
