Bio-strato Interferometria per Cinetica di interazioni proteina-proteina e allosterici effetti Ligand di misura

Interazioni proteina-proteina sono importanti per molti processi biologici e metodi ottici label-free come Surface Plasmon Resonance (SPR) sono stati utilizzati in vitro per studiare la cinetica di legame e di dissociazione ^1. La maggior parte dei metodi di label-free immobilizzare uno biomolecole su una superficie del sensore e utilizzare un segnale ottico per rilevare un partner di legame dalla soluzione in quanto si associa con la biomolecola immobilizzata ^1. Mentre SPR è un metodo altamente sensibile, è soggetta a interferenze dovute a variazioni dell'indice di rifrazione della soluzione scorre sopra il sensore ^2. Anche se non è così sensibile come SPR, Bio-strato Interferometria (BLI) è meno influenzata dai cambiamenti nella composizione del campione ^1,3. BLI utilizza biosensori in fibra ottica che hanno un rivestimento biocompatibile proprietaria alla punta. Il sistema utilizzato here (Octet-RED96) contiene otto spettrofotometri. La luce bianca viene convogliata ad una fila di sonde che si muovono su un braccio robotico. Sensori in fibra ottica are raccolto dalle sonde e spostata in una piastra a 96 pozzetti contenenti campioni. Una delle molecole bersaglio è immobilizzato sulla superficie del biosensore. Poi sensori vengono spostati pozzetti contenenti il ​​partner di legame in soluzione. BLI monitora associazione del partner di legame con la molecola immobilizzata, quindi controlla dissociazione dopo aver spostato i sensori di soluzione senza il partner di legame. Il legame di molecole di superficie biosensore comportano modifiche interferenza ottica tra le onde luminose che riflettono indietro ai spettrofotometri da una superficie interna e dall'interfaccia esterna tra il sensore e la soluzione. Questi cambiamenti di interferenza possono essere quantificate e utilizzati per determinare i tassi cinetiche di legame e di dissociazione, come riassunto nell'animazione della figura 1.

Abbiamo applicato BLI per misurare le interazioni tra il complesso catalitico di ATP sintasi batterica e la sua subunità ε, che può auto-inibire l'enzima. ATP synthase è un nanomotor rotativo membrana integrato che catalizza la sintesi e idrolisi di ATP ^4. Il complesso catalitico (F ₁₎ può essere isolato in forma solubile che funziona come un ATPasi. Subunità ε ha due domini: il dominio N-terminale (NTD) è necessaria per il corretto montaggio e l'accoppiamento funzionale dell'enzima, ma non interagire direttamente con le subunità catalitiche, il dominio C-terminale (CTD) in grado di inibire l'enzima interagendo con più subunità catalitiche ^5,6. Questo regolamento ε-mediata è specifico per ATP sintasi batteriche e non è osservata nel omologo mitocondriale. ATP sintasi è emerso come un bersaglio per farmaci antibatterici, come dimostrato dalla recente approvazione della FDA di bedaquiline per il trattamento della tubercolosi farmaco-resistente ^7. Così, il targeting ruolo inibitorio di ε per la scoperta della droga potrebbe produrre antibatterici che non inibiscono la mitocondriale ATP sintasi. Con l'isolato complesso catalitico (F _1), εdiventa una subunità dissociabile. Tuttavia, con ε vincolato a F _1, il εCTD può subire un drastico cambiamento conformazionale, parzialmente inserito nella cavità centrale dell'enzima e formando uno stato inibitorio che difficilmente dissociare direttamente ^6,8. Usiamo BLI per misurare cinetica di F ₁ / ε associazione e la dissociazione e, indirettamente, per esaminare gli effetti allosterici di catalizzatore sito ligandi sulla conformazione di ε.

Nel nostro sistema, ε è stato scelto per l'immobilizzazione sulla superficie del sensore dal segnale BLI (come SPR) è sensibile alla massa dei leganti in superficie molecole. La subunità ε è piccolo (~ 15 kDa) rispetto alla principale F ₁ complesso (~ 347 kDa). Così, un segnale BLI più grande sarà il risultato di legame di F ₁ a ε immobilizzato. Per monitorare F ₁ dissociazione, che può essere molto lento, ε deve essere fortemente immobilizzato. Così abbiamo scelto di biotinylateE immobilizzarlo sul biosensori rivestite di streptavidina. Le proteine ​​possono essere biotinilati (i) modifica casuale di lisine superficie ^9, (ii) reazione di un unico cisteina nativa o attrezzata con biotina-maleimmide reagente ¹⁰ o (iii) geneticamente aggiungendo uno specifico peptide biotina-accettore che viene enzimaticamente biotinilato durante espressione in vivo della proteina marcata ^11. Nel nostro sistema, ε è biotinilato utilizzando il metodo (iii) ^8. Una volta ε biotina-tag è immobilizzato su sensori streptavidina, BLI può misurare l'associazione e dissociazione di F _1, che è stato impoverito di subunità ε (F ₁ (-ε)). Per gli esperimenti qui descritti, saggi preliminari sono stati condotti per determinare ragionevole quantità di proteina biotinilato per immobilizzare sui sensori. Questo può variare, a seconda del peso molecolare della proteina e il suo partner di legame, ma l'obiettivo è quello di determinare una quantità minima di proteina immobilizzata tcappello prevede (i) accettabile segnale-rumore per il legame cinetica con una bassa concentrazione del partner di legame (di seguito K _D) e (ii) una distorsione minima di cinetica di legame con concentrazione quasi saturazione del partner di legame. Inoltre, stechiometria biotinilazione può variare (ma evitare> 1 mol biotina / proteine ​​mol), per cui alcuni dosaggio iniziale può essere necessario per ogni nuovo lotto di proteine ​​biotinilato per confermare che un segnale coerente BLI può essere raggiunto durante l'immobilizzazione sulla streptavidina-rivestito sensori.