タンパク質 - タンパク質相互作用およびアロステリックリガンド効果の反応速度を測定するためのバイオレイヤー干渉法

タンパク質-タンパク質相互作用は、多くの生物学的プロセスのために重要であり、表面プラズモン共鳴（SPR）のようなラベルフリー光学的方法¹の^結合及び解離の動態を研究するためにインビトロで使用されてきた。ほとんどのラベルフリーの方法は、センサ表面上の1生体分子を固定化し、それが固定化された生体分子¹と会合するように溶液から結合パートナーを検出するための光信号を使用しています。 SPRは、高感度な方法であるが、それは、センサ²の上を流れる溶液の屈折率の変化による干渉を受けやすい。 SPRほど敏感ではないが、バイオレイヤー干渉法（BLI）が少ないサンプル組成^1,3の変化に影響される。 BLIは、先端に独自の生体適合性コーティングを有する光ファイババイオセンサーを使用しています。 （オクテットRED96）ここで使用されるシステムは、8つの分光光度計が含まれています。白色光は、ロボットアームに移動したプローブの行にパイプされる。光ファイバセンサのアルeは、プローブによってピックアップされたサンプルを含む96ウェルプレートに移動した。標的分子の一つは、バイオセンサー表面上に固定化される。次いで、センサは、溶液中の結合パートナーを含むウェルに移動される。 BLIは固定化された分子と結合パートナーとの会合を監視してから、結合相手なしでソリューションにセンサーを移動した後に解離を監視します。バイオセンサー表面への分子の結合は、内面からとセンサと溶液との間の外部インタフェースからの分光光度計に戻って反映させる光波の間の光の干渉の変化につながる。干渉におけるこれらの変化を定量化し、 図1のアニメーションにまとめたように、結合および解離の速度論的速度を決定するために用いることができる。

私たちは、酵素を自動阻害することができる細菌のATP合成酵素とそのεサブユニットの触媒複合体の間の相互作用を測定するために、BLIを適用している。 ATP SYnthaseは、ATP ⁴の合成と加水分解を触媒膜に埋め込 ​​まれた回転ナノモーターである。触媒複合体（F _{1）は、ATP}アーゼとして機能する可溶性の形で単離することができる。サブユニットεは二つのドメインを持っている：N末端ドメイン（NTD）は適切な組み立てと、酵素の機能的結合のために必要であるが、触媒サブユニットと直接相互作用しない。C末端ドメイン（CTD）がと相互作用することによって酵素を阻害することができる複数の触媒サブユニット^5,6。このε媒介規制は細菌のATP合成酵素に特有のものであり、ミトコンドリアの相同体で観察されていません。薬剤耐性結核^7を治療するbedaquilineの最近のFDAの承認で示すように、ATP合成酵素は、抗菌薬のターゲットとして浮上している。これにより、創薬のためのεの阻害的役割を標的とすることは、ミトコンドリアATP合成酵素を阻害しない抗菌剤を得ることができる。孤立した触媒錯体（F _1）、εと解離性サブユニットになる。しかし、F ₁に結合しているεで、εCTDは部分的に酵素の中央空洞内に挿入し、直接^6,8解離性は低い抑制状態を形成し、劇的な構造変化を受けることができる。我々は、触媒サイトがεのコンフォメーション上のリガンドのアロステリック効果を調べるために、間接的にFが₁ /ε結合と解離の反応速度を測定し、するBLIを使用しています。

（SPR等）BLI信号が表面に結合する分子の質量に敏感であるので、我々のシステムにおいては、εは、センサ表面に固定化するために選択した。 εサブユニットは、メインF ₁複合体（〜347 kDa）の、小さな（〜15 kDa）の相対的です。このように、より大きなBLI信号が固定化されたεに、F ₁の結合からなります。非常に遅くなることが、F ₁解離を、監視するために、εは強く固定化されている必要があります。したがって、私たちは、ビオチン化することにしました、およびストレプトアビジンでコーティングされたバイオセンサー上に固定。タンパク質は、表面リジン⁹の（I）のランダム変更、ビオチン-マレイミド試薬¹⁰または（iii）遺伝的に酵素的に中にビオチン化され、特定のビオチンアクセプターペプチドを付加した独自のネイティブまたはシステイン（II）の反応により、ビオチン化することができるタグ付けされた蛋白質¹¹のin vivo発現における 。我々のシステムでは、εは法^{（III）8を}使用してビオチン化する。ビオチンタグ化εストレプトアビジンセンサー上に固定化されると、BLI結合およびサブユニットε（F _{1（-ε））}を枯渇されたF ₁の解離を測定することができる。ここに記載の実験のために、予備的アッセイは、センサー上に固定化するためにビオチン化タンパク質の合理的な量を決定することは行われていた。これは、タンパク質の分子量およびその結合パートナーに応じて、変えることができるが、目標は、固定化タンパク質tの最小量を決定することである帽子は、（i）許容信号対雑音（K _D下）結合パートナーの濃度が低いと結合パートナーのほぼ飽和濃度との結合動態（II）の最小限の歪みで反応速度を結合するために用意されています。また、ビオチンの化学量論は一貫BLI信号は、ストレプトアビジン被覆上に固定化の間に達成することができることを確認するために変化する（ただし、> 1モルビオチン/モルタンパク質を避ける）ため、いくつかの初期のアッセイは、ビオチン化タンパク質のそれぞれ新しいロットのために必要とされてもよいセンサー。