Summary

Identificazione di geni novelli associati con alginato di produzione in<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Utilizzo Mini-<em> Himar1</em> Mutagenesi Mariner Transposon-mediata

Published: March 10, 2014
doi:

Summary

Qui si descrive un protocollo con il mini-himar1 mariner trasposone-mediata mutagenesi per generare una libreria mutante inserimento ad alta densità per schermo, isolare ed identificare i regolatori alginato romanzo nel prototipo Pseudomonas aeruginosa ceppo PAO1.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa è un batterio Gram-negativo, batterio ambientale con versatili capacità metaboliche. P. aeruginosa è un batterio patogeno opportunista che stabilisce le infezioni polmonari croniche in pazienti con fibrosi cistica (CF). La sovrapproduzione di un polisaccaride capsulare chiamato alginato, noto anche come mucoidy, promuove la formazione di biofilm mucoide che sono più resistenti rispetto alle cellule planctoniche alla chemioterapia antibiotica e difese dell'ospite. Inoltre, la conversione dal nonmucoid al fenotipo mucoide è un marcatore clinico per l'insorgenza di infezione cronica in CF. Sovrapproduzione alginato di P. aeruginosa è un processo ergoniche che tassa pesantemente energia cellulare. Di conseguenza, la produzione di alginato è altamente regolamentato in P. aeruginosa. Per capire meglio regolamentazione alginato, si descrive un protocollo utilizzando il mini-himar1 trasposone mutagenesi per l'identificazione di regolatore alginato romanzos in un ceppo PAO1 prototipo. La procedura si compone di due fasi fondamentali. In primo luogo, abbiamo trasferito il trasposone mini-himar1 (pFAC) dall'host E. coli SM10/λpir in destinatario P. aeruginosa PAO1 via coniugazione biparental per creare una libreria di mutante inserimento ad alta densità, che sono stati selezionati su piastre di isolamento di Pseudomonas agar addizionato con gentamicina. In secondo luogo, abbiamo proiettato e isolate colonie mucoidi per mappare il sito di inserimento attraverso inversa PCR usando primer DNA puntano verso l'esterno dal cassetto gentamicina e sequenziamento del DNA. Usando questo protocollo, abbiamo identificato due nuovi regolatori di alginato, MUCE (PA4033) e kinB (PA5484), in ceppo PAO1 con una wild-type Muca che codifica per il fattore anti-sigma Muca per il regolatore di alginato maestro AlgU (ALGT, σ 22) . Questo protocollo mutagenesi ad alta produttività può essere modificato per l'identificazione di altri geni di virulenza legate causando variazione colony morfologia.

Introduction

La capacità del opportunistica, patogeno Gram-negativo Pseudomonas aeruginosa produrre in eccesso alginato è un fattore importante nella sua capacità di stabilire un biofilm. La sovrapproduzione di alginato è un fenotipo spesso indicato come mucoidy. L'isolamento di colonie mucoidi dal espettorati di individui affetti da fibrosi cistica (CF) è indicativo di una infezione cronica, ed è direttamente associata ad un declino generale della salute del paziente 1. Attualmente, resta inteso che la regolazione e la produzione di alginato in P. aeruginosa si verifica principalmente a due operoni. Il primo è l'operone biosintetica alginato, che contiene 12 geni (algDalg8alg44algKAlgealgGalgXalgLAlgialgJalgFAlga), che sono responsabili per la sintesi e l'esportazione del polimero alginato di tutti periplasma al environme extracellularent 2-5. Il secondo operone è un cluster di geni che inizia con il fattore sigma alternativo algU / T e continuando con muca, mucB, e mucD. AlgU / T è un regolatore positivo, mentre mucAB-D sono classificati come regolatori negativi della produzione alginato 6-8. Inoltre, regolatori trascrizionali, come ALGB, AlgQ, ALGR, e RpoN, così come post-trascrizionale e modificazione post-traslazionale dal controllo repressione da cataboliti, l'attività chinasi (KinB) e proteolisi intramembrane, hanno anche dimostrato di essere coinvolti in alginato regolamentazione 9-14.

Il trasposone vettore mini-himar1 noto come pFAC è stato originariamente creato nel laboratorio Dr. Mekalanos 'presso la Harvard Medical School 15. Il plasmide pFAC consiste di un elemento trasponibile fiancheggiato da due ripetizioni invertite di 27 bps e una cassetta gentamicina resistenza nel mezzo (aacC1: 534 bp), un gene che codifica la hyperactive transposase mariner 16, e un gene codificante β-lattamasi (bla) (Figura 1). Informazioni di sequenza per l'elemento trasponibile di pFAC è disponibile al numero di accesso GenBank: DQ366300 13. In pFAC, c'è un sito di clonazione multipla (MCS) dietro il gene aacC1 che viene utilizzato per l'identificazione del sito di inserzione cromosomico mediante PCR inversa. Uno dei principali vantaggi con l'utilizzo del trasposone mini-himar1 è alcuna fattori dell'ospite specifici sono necessari per il recepimento (mutagenesi). Inoltre, vi è grande abbondanza dei TA dinucleotidici siti di inserzione trovati in tutto il genoma del P. aeruginosa. Ad esempio, TA siti di inserzione dinucleotide si verifica 94.404 e 100.229 volte in PAO1 (6.264.404 bps, GenBank numero di accesso NC_002516.2) e PA14 (6.537.648 bps, il numero di accesso GenBank NC_008463) genomi, rispettivamente. A causa della abbondanza di TA dinucleotide nel genoma, mini-himar1 </em> Trasposone può causare l'alta densità e mutagenesi casuale, che è particolarmente adatto per l'analisi di geni di virulenza e geni che sono altamente regolamentati. Teoricamente, il trasposone mini-himar1 può inserire in qualsiasi gene non essenziale all'interno del genoma di P. aeruginosa. Questo fornisce circa 18 TA siti di inserzione per fase di lettura aperta nel genoma PAO1.

Qui, descriviamo un protocollo con mini-himar1 trasposone-mediata mutagenesi per identificare nuovi regolatori di mucoidy in P. aeruginosa. Più specificamente, si biparentally coniugato il vettore pFAC contenente un trasposone mini-himar1 da E. coli SM10/λpir nel nonmucoid prototrofici ceppo PAO1. Dopo il trasposone è integrato nel genoma, il ceppo ricevente è in coltura su agar isolamento Pseudomonas (PIA) contenente triclosan che inibisce la crescita di E. coli. Così, una libreria di mutanti di <em> P. aeruginosa può essere selezionato dalla crescita su PIA piastra integrata con gentamicina e la presenza del fenotipo mucoide. Nota, una vera trasposone-mediata contro un mutante integrazione avrà un fenotipo resistente e carbenicillina sensibile gentamicina. In questo studio, circa 80.000 mutanti inserimento di PAO1 sono stati isolati attraverso quattro coniugazioni separate. Abbiamo poi proiettato per isolati mucoidi, e determinato il sito di inserimento da enzimi di restrizione, la legatura e inversa PCR. Abbiamo eseguito analisi Southern blot utilizzando la cassetta di resistenza gentamicina come sonda per vedere il numero di inserimento per genoma. Abbiamo determinato che oltre il 90% dei mutanti ottenuti per coniugazione usando questo protocollo aveva solo una singola copia del himar1 nel genoma e visualizzato il fenotipo resistente e carbenicillina sensibile gentamicina. Un totale di 32 ceppi mucoidi sono stati identificati, 22 di loro sono stati mappati a diversi loci del P. aeruginosa PAO1cromosoma. Questo tasso di inserimento prevede una copertura adeguata per individuare alcuni nuovi regolatori di sovrapproduzione alginato.

Protocol

1. Preparazione di ceppi batterici e biparental Coniugazione Seminare E. coli SM10/λpir/pFAC in 5 ml di Luria Broth (LB), completata con 15 mg / ml di gentamicina e posto in un incubatore agitazione durante la notte a 37 ° C. Seminare P. aeruginosa ceppo PAO1 in 5 ml di LB, e posto in un incubatore agitazione per una notte a 42 ° C. Misurare OD 600 di culture durante la notte e mescolare quantità uguali di PAO1 ed E. coli pFAC tale che il volume fi…

Representative Results

Come illustrato nella Figura 1, il mini-himar1 mariner trasposone vettore, pFAC, contiene due ripetizioni invertite 27 bp con siti di inserzione TA fiancheggianti la cassetta resistenza aacC1 gentamicina, con il suo promotore σ 70-dipendente, e un sito di clonazione multipla (MCS). Inoltre, il vettore pFAC contiene i geni che codificano la transposase altamente attiva himar1, β-lattamasi (bla), e l'operone trasferimento tra. I siti di inserzi…

Discussion

È importante notare che questo metodo può essere utilizzato in altre specie Pseudomonas con queste alterazioni: incubare P. fluorescens e P. putida a 30 ° C, e P. stutzeri a 42 ° C; P. stuzeri deve essere coltivato su piastre LB addizionato con 150 mg / ml di gentamicina, sul passo 1.11, pag cellule stutzeri devono essere trasferiti in 500 ml di LB invece di 1 ml. Inoltre, ci sono due passaggi critici per questo protocollo. In primo luogo, il ceppo ricev…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato dal Aeronautics and Space Administration West Virginia Spazio di Grant Consorzio Nazionale (NASA WVSGC), Cystic Fibrosis Foundation (CFF-YU11G0) e NIH P20RR016477 e P20GM103434 all'idea Network West Virginia per la Ricerca Biomedica Eccellenza. Ringraziamo Vonya M. Eisinger per l'assistenza tecnica con questo lavoro.

Materials

Luria Broth Difco 240230 via Fisher Scientific
Pseudomonas isolation agar Difco 292710 via Fisher Scientific
Small Plates (100 O.D. x 10 mm) Fisher Scientific 08-757-13
Large Plates (150 O.D. x 15 mm) Fisher Scientific 08-757-14
Glycerol Fisher Scientific BP229-4
Benchtop Shaking Incubator New Brunswick Scientific Innova 4080 shake at 200 rpm
Cabinet Incubator VWR 1540
Benchtop Microcentrifuge Sorvall 75-003-287 via Fisher Scientific
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 or preferred method/vendor
Diposable Inoculation Loops Fisher Scientific 22-363-597
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 05-408-129
2.0 mL Cryogenic Vials Corning 430659 via Fisher Scientific
15 mL Tubes Fisher Scientific 05-539-12
Skim Milk Difco DF0032-17-3 via Fisher Scientific
DNeasy Blood and Tissue (250)  Qiagen 69506 or preferred method/vendor
QIAquick PCR Purification Kit (250) Qiagen 28106 or preferred method/vendor
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)  Qiagen 27106 or preferred method/vendor
FastLink II DNA Ligation Kit Epicentre Technologies LK6201H via Fisher Scientific
Accu block Digital Dry Bath  Labnet NC0205808 via Fisher Scientific
Sal1, restriction endonuclease New England BioLabs R0138L
EasyStart Micro 50 Molecular BioProducts 6020 via Fisher Scientific
Taq DNA Polymerase New England BioLabs M0267L
iCycler, Thermocycler Bio-Rad 170-8740
LE agarose Genemate 3120-500 via Fisher Scientific
Gentamycin Sulfate Fisher Scientific BP918-1
2.0 mL Cryogenic Vials Corning 430659 via Fisher Scientific

Referencias

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Withers, T. R., Yin, Y., Yu, H. D. Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis. J. Vis. Exp. (85), e51346, doi:10.3791/51346 (2014).

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