활성화 및 인간 단핵구 유래 수지상 세포에서 IL-1β를 사용하여 NLRP3 inflammasome을 활동의 측정
Summary
수지상 세포 (DC가) nigericin와 NLRP3의 inflammasome을 활성화 한 다음 합성 퓨린, R848의 TLR8 인식에 응답하여 IL-1β 분비, 따라서 IL-1β는 NLRP3의 inflammasome을 활동을 측정하는데 사용될 수있다. 세포 내 사이토 카인 염색법, 면역 블롯 및 ELISA 정확하게 IL-1β의 발현을 통해 NLRP3의 프라이밍 inflammasome을 및 활성화를 측정하는 데 사용됩니다.
Abstract
인터루킨의 분비 (IL)으로 인해 발생하는 염증성 과정 -1 면역 세포에 의해 가족의 사이토 카인이 로컬 또는 전신 염증, 조직 리모델링 및 수리, 및 바이러스 학적 제어 1, 2로 이어집니다. 인터루킨-1β는 타고난 면역 반응에 필수적인 요소이며 지속적인 감염 1-5의 설립을 방지하면서 병원균 침입 제거에 기여한다.
Inflammasomes 1 전환 효소 (ICE 또는 카스파 1) 인터루킨의 활성화를위한 키 신호 플랫폼이다. NLRP3의 inflammasome을은 IL-1β 분비 6을 일으키는 DC가 적어도 두 개의 신호가 필요합니다. 프로 IL-1β 단백질 발현이 세포를 휴식에 제한된다; 따라서 프라이밍 신호는 IL-1β의 전사 및 단백질 발현에 필요합니다. 다중 단백질 NLRP3 inflammasome을 이용의 형성 NLRP3 결과에 의해 감지 제 2 신호. IR 업무 수지상 세포의 기능IL-1β 분비에 필요한 신호 D는 박테리아 독소와 NLRP3의 inflammasome을 활성화 한 다음 주요 세포 돌기 세포 (moDCs)을 파생 사람의 단핵구에서 TLR8에 의해 감지되는 합성 퓨린, R848을 사용하여 테스트 할 수 있습니다 칼륨 이온 운반체, nigericin.
단핵구 유래 수지상 쉽게 문화의 생산과 정제 된 인간의 골수의 수지상보다 훨씬 더 많은 세포를 제공한다. 그 대신 파생 마우스, DC가, 따라서 인간의 질병과 감염에 inflammasome을의 연구를 허용 체외 인간에 사용하는 여기에 제시된 방법은 다른 inflammasome을 분석 실험 다릅니다.
Introduction
타고난 면역 시스템의 활성화는 감염, 질병, 예방 접종 7시 적응 면역 반응을 조종하는 데 필요합니다. 수지상 세포는 선천성 면역 체계의 세포를 제시하는 가장 강력한 항원이다; 그들은 항원의 흡수, 림프절 마이그레이션, 순진 CD4 +와 CD8 + T 세포 용해 세포 8-10의 활성화를 위해 전문화되어 있습니다. 빠른 병원체 검출을 사용하려면 타고난 면역 시스템은 보존 병원체 파생 모티브 또는 세포 스트레스와 손상의 호스트 파생 마커를 인식하는 수많은 생식 인코딩 패턴 인식 수용체 (PRR)를 사용합니다. 수용체 (TLR에) 같은 전화는 특정 세포 phagocytized 병원균 관련 분자 패턴 (PAMPS) 및 위험 관련 분자 패턴 (감쇠)를 인식 막 결합 패턴 인식 수용체이다. 수용체 (NLRs) 같은 대비 고개를 끄덕으로 세포질하고 PAMPS 및 감쇠의 다양한 범위에 응답합니다. 수용체가 다시 같이 고개를 끄덕세포 표면 및 세포 내 이입 PRRS을 회피 병원균에 대한 방어의 두 번째 라인을 제시한다. 파생 병원균, 또는 "위험"의 상호 작용, 관련 TLR과 NLR 리간드 요소는 다른 면역 세포와 T 세포와 자연 살해 세포 활성화 (11)의 승진 증가 DC의 상호 작용의 결과로 DC의 성숙의 상태에 이르게한다.
인터루킨-1β는 감염에 대한 숙주 방어의 중요한 구성 요소입니다. 미생물의 인식 시점이 높은 염증성 사이토 카인 IL-1β가 분비되고 화학 유인과 타고난 및 적응 면역 세포의 활성화 등의 기능은. 생체 내 IL-1β는 발열과 염증성 사이토 카인 등의 급성기 응답을 크게 책임이있다 합성 12.
대부분의 NLRs 리간드 감지, 물질 œ 인 중앙 염기 결합 도메인 (NACHT)에서 작동하는 것으로 생각되는 C 터미널 류신이 풍부한 반복 도메인을 포함NLRP3의 올리고머, 단백질 단백질 상호 작용을 통해 다운 스트림 대상에 신호 전달을 매개 N 터미널 이펙터 도메인 (NLRP3의 PYD)에 대한 rtant. NLRP3 단백질은 가장 강렬하게 공부 inflammasome을 단지를 정의합니다. 이 단백질은 NLR 가족의 일원이고 NLRP3 (또한 ASC라고도 함) 어댑터 단백질 PYCARD 및 ICE 이루어지는 멀티 분자량 단백질 복합체를 형성하는 기능을 갖는다. inflammasome을 활성화시 PYCARD은 NLRP3 N 단말기 도메인에 바인딩하고 카스파 제 활성화 및 채용 도메인 (CARD) 도메인을 통해 ICE를 모집합니다. 인터루킨-1 전환 효소는 처음의 N-말단에 카드 모티브를 포함하는 효소 원으로 생성됩니다. 두 ICE의 분자를 데려 inflammasome을 형성 결과는 충분히 닫고 촉매 활성화를 유도한다. inflammasome을 단지는 사이토 카인 성숙 세포질 프로 IL-1β를 변환 할 수 있도록하여 ICE 활성화가 필요합니다.
IL 성공적으로 분비-1β의 DC에있는 두 개의 서로 다른 독립적 인 위험 신호를 감지해야합니다. 첫째, PAMPS, 감쇠, 또는 사이토 카인 신호 (TNFα 나 IL-1β)의 TLR 감지 세포질 프로 IL-1β 단백질 발현의 상향 조절됩니다. 두 번째, 종종 다른 신호는 ICE의 성숙의 상류 inflammasome을 복합체 형성이 필요합니다. 신호를 자극하는 몇 inflammasome을 세균 막 기공 (예 nigericin)를 형성하는 독소 (예 : 글루타민산 소다 요 산염 결정, MSU 등) 리소좀 중단 결정하고, 세포 외 ATP (가) 있습니다. 이러한 다양한 활성제에 의해 inflammasome을 활성화 NLRP3로 이어지는 상류 메커니즘은 명확하지 않다. inflammasome을 형성 시그널링 상류 조사 연구는 저칼륨 유도 또는 반응성 산소 종 (ROS)와 같은 세포 내 사건 간접적 inflammasome을 13-28을 활성화하는 것이 제안되어있다.
NLRP3의 inflammasome을 서로 다른 바이러스 성 활성제의 사이에 B를 제공 인플루엔자이며,IL-1β 분비 3, 29-33에 필요한 기본 및 보조 신호 OTH. 마우스 NLRP3 녹아웃 모델을 사용하여이 DC에있는 IL-1β의 분비가 32 NLRP3 의존하는 것으로 나타났습니다. 또한, NLRP3 녹아웃 마우스는 감염의 사이트에 적은 백혈구을 받고 높은 사망률 2, 5를 경험했다. 최근 두 논문은 인플루엔자 바이러스 감염시 NLRP3의 inflammasome을 활성화하기위한 메커니즘을 제안; 첫 번째, 두 번째 신호 다음에 세포질 프로 IL-1β 발현을 유도하는 TLR7 또는 TLR8 (응답 세포의 TLR의 발현에 따라 다름)에 의해 또는 다른 TLR에 의한 공생 박테리아의 검출을 통해 바이러스 성 RNA, NLRP3의 활성화의 인식을 통해 프라이밍 트랜스 골지 네트워크 (33, 34)에 바이러스 성 이온 채널 단백질 (M2)로 inflammasome을 형성. 후자의 공정에서, NLRP3의 inflammasome을 트리거링은 세포 내 이온의 외란에 의해 달성된다 <EM> inflammasome을 형성하는 신호로서 NLPR3 의해 감지 단순히이다 ROS 생산으로 이어지는 환경. 그러나, 인플루엔자 감염시 ICE 활동의 inflammasome을 활성화 상류의 정확한 메커니즘은 아직 불분명하게 남아있다.
이 작품은 잘으로 inflammasome을 활성화 한 다음 R848과 TLR8 결찰에 대한 응답을 기준으로 DC의 기초가되는 경로 IL-1β 분비의 추가 조사를위한 기초로 사용할 수 있습니다 인간의 moDCs에서 NLRP3의 inflammasome을 공부를위한 가치있는 기술을 설명합니다 NLRP3의 알려진 활성제, nigericin. 이 방법의 변형을 포함하는 다른 세포 유형과 함께 사용하지만, 이에 한정되지 수 : 단핵구, 대 식세포, 다른 DC 서브 세트 및 상피 세포.
Protocol
Representative Results
Discussion
염증성 사이토 카인은 바이러스 감염을 싸울 타고난 및 적응 면역 반응을 스티어링에 통합되어 있습니다. 분비되는 IL-1β는 인플루엔자 감염 3, 43, 44시 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 사이토 카인이 인간의 수지상 세포에 바이러스 성 인식에 대한 응답으로 처리됩니다되는 정확한 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 골수성 DC 아이솔레이션 키트는 비용과 시간이 걸린다. 격리 키?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 자신의 지원과 피드백을 올리비에 Manches, 박사, Davor Frleta 박사와 메건 오브라이언, MD를 인정하고 싶습니다. 이 연구는 알레르기 및 전염병 국립 연구소에 의해 지원 및 NIH는 건강 관련 연구 (AI089030)와 RO1 (AI081848의 다양성을 촉진하기 위해 개별 Predoctoral 동호회 (F31)에 루스 L. 키르 국립 연구 봉사상을 부여 자금으로 완료되었습니다 ).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| IL-4 | R&D | ||
| GM-CSF | Genzyme | NDC 58468-0180-2 | We acquire this item through our local pharmacy with a prescription |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Cellgro | 10-040-CV | |
| Peripheral blood mononuclear cells | New York Blood Center | PBMCs were isolated from the blood of healthy donors | |
| 12-well tissue culture plates | Sigma-Aldrich | 3516 | |
| 96-well round bottom tissue culture plates | Sigma-Aldrich | 3799 | |
| α-IL-1β-FITC | R&D | IC201F | |
| FITC isotype control | Miltenyi Biotec | 130-092-213 | |
| α-β-Tubulin | Santa Cruz | SC-9014 | |
| α-IL-1β | R&D | mab201 | |
| PVDF Immobilon-FL membrane | Millipore | IPFL00010 | |
| gradient 4-12 % polycrylamide gel | Bio Rad | 161-1159 | |
| laemmli sample buffer | Bio Rad | 161-0737 | |
| BSA | Equitech Bio Inc | 30% solution sterile/filtered | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 16% solution |
| human inflammatory cytokine bead array kit | BD | 551811 | |
| nigericin | Invivogen | tlrl-nig | |
| R848 | 3M Corp. | ||
| α-CD14 | BD | 340436 | |
| α-CD11c | BD | 555392 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| TBS | On site stock room | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287-100mL | |
| Nunc EasYFlask 225cm2, Filter Cap, 70mL working volume, 30/Cs | Thermo Scientific | 159933 | |
| 20 μM Sterile Disposable Filter Units | Thermo Scientific | 569-0020 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750060 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| goat α-mouse IRDye 800CW | Licor | 926-32210 | |
| donkey α-rabbit IRDye 680RD | Licor | 926-68073 | |
| Spectra multicolor broad range protein ladder | Thermo Scientific | 26634 | |
| Tris Glycine SDS 10x | Bio Rad | 1610732 | |
| Tris Glycine 10x | Bio Rad | 161-0734 | |
| Methanol – 4L | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P-36931 | |
| 8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide | BD Falcon | 354108 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 |
Referencias
- Durrant, D. M., Robinette, M. L., Klein, R. S. IL-1R1 is required for dendritic cell-mediated T cell reactivation within the CNS during West Nile virus encephalitis. The Journal of Experimental Medicine. 210, 503-516 (2013).
- Thomas, P. G., et al. The intracellular sensor NLRP3 mediates key innate and healing responses to influenza A virus via the regulation of caspase-1. Immunity. 30, 566-575 (2009).
- Schmitz, N., Kurrer, M., Bachmann, M. F., Kopf, M. Interleukin-1 is responsible for acute lung immunopathology but increases survival of respiratory influenza virus infection. Journal of Virology. 79, 6441-6448 (2005).
- Pang, I. K., Ichinohe, T., Iwasaki, A. IL-1R signaling in dendritic cells replaces pattern-recognition receptors in promoting CD8(+) T cell responses to influenza A virus. Nat Immunol. 14, 246-253 (2013).
- Allen, I. C., et al. The NLRP3 inflammasome mediates in vivo innate immunity to influenza A virus through recognition of viral RNA. Immunity. 30, 556-565 (2009).
- Bauernfeind, F. G., et al. Cutting edge: NF-kappaB activating pattern recognition and cytokine receptors license NLRP3 inflammasome activation by regulating NLRP3 expression. J Immunol. 183, 787-791 (2009).
- Zabel, F., Kundig, T. M., Bachmann, M. F. Virus-induced humoral immunity: on how B cell responses are initiated. Current Opinion in Virology. , (2013).
- Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nature Medicine. 13, 1155-1159 (2007).
- Bhardwaj, N., et al. Influenza virus-infected dendritic cells stimulate strong proliferative and cytolytic responses from human CD8+ T cells. The Journal of Clinical Investigation. 94, 797-807 (1994).
- Sheng, K. C., Day, S., Wright, M. D., Stojanovska, L., Apostolopoulos, V. Enhanced Dendritic Cell-Mediated Antigen-Specific CD4+ T Cell Responses: IFN-Gamma Aids TLR Stimulation. Journal of Drug Delivery. 2013, (2013).
- Pohl, C., Shishkova, J., Schneider-Schaulies, S. Viruses and dendritic cells: enemy mine. Cellular Microbiology. 9, 279-289 (2007).
- Dinarello, C. A. Cytokines as mediators in the pathogenesis of septic shock. Curr Top Microbiol Immunol. 216, 133-165 (1996).
- Petrilli, V., et al. Activation of the NALP3 inflammasome is triggered by low intracellular potassium concentration. Cell Death and Differentiation. 14, 1583-1589 (2007).
- Hussen, J., Duvel, A., Koy, M., Schuberth, H. J. Inflammasome activation in bovine monocytes by extracellular ATP does not require the purinergic receptor P2X7. Developmental and Comparative Immunology. 38, 312-320 (2012).
- Rajamaki, K., et al. Extracellular Acidosis Is a Novel Danger Signal Alerting Innate Immunity via the NLRP3 Inflammasome. The Journal of Biological Chemistry. 288, 13410-13419 (2013).
- Ayna, G., et al. ATP release from dying autophagic cells and their phagocytosis are crucial for inflammasome activation in macrophages. PLoS One. , (2012).
- Vyleta, M. L., Wong, J., Magun, B. E. Suppression of ribosomal function triggers innate immune signaling through activation of the NLRP3 inflammasome. PLoS One. 7, (2012).
- Lacroix-Lamande, S., et al. Downregulation of the Na/K-ATPase pump by leptospiral glycolipoprotein activates the NLRP3 inflammasome. J Immunol. 188, 2805-2814 (2012).
- Segovia, J., et al. TLR2/MyD88/NF-kappaB pathway, reactive oxygen species, potassium efflux activates NLRP3/ASC inflammasome during respiratory syncytial virus infection. PLoS One. 7, (2012).
- Hamon, M. A., Cossart, P. K. K+ efflux is required for histone H3 dephosphorylation by Listeria monocytogenes listeriolysin O and other pore-forming toxins. Infection and Immunity. 79, 2839-2846 (2011).
- Schorn, C., et al. Sodium overload and water influx activate the NALP3 inflammasome. The Journal of Biological Chemistry. 286, 35-41 (2011).
- Said-Sadier, N., Padilla, E., Langsley, G., Ojcius, D. M. Aspergillus fumigatus stimulates the NLRP3 inflammasome through a pathway requiring ROS production and the Syk tyrosine kinase. PLoS One. 5, (2010).
- Arlehamn, C. S., Petrilli, V., Gross, O., Tschopp, J., Evans, T. J. The role of potassium in inflammasome activation by bacteria. The Journal of Biological Chemistry. 285, 10508-10518 (2010).
- Chu, J., et al. Cholesterol-dependent cytolysins induce rapid release of mature IL-1beta from murine macrophages in a NLRP3 inflammasome and cathepsin B-dependent manner. Journal of Leukocyte Biology. 86, 1227-1238 (2009).
- Silverman, W. R., et al. The pannexin 1 channel activates the inflammasome in neurons and astrocytes. The Journal of Biological Chemistry. 284, 18143-18151 (2009).
- Piccini, A., et al. ATP is released by monocytes stimulated with pathogen-sensing receptor ligands and induces IL-1beta and IL-18 secretion in an autocrine way. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 8067-8072 (2008).
- Wickliffe, K. E., Leppla, S. H., Moayeri, M. Anthrax lethal toxin-induced inflammasome formation and caspase-1 activation are late events dependent on ion fluxes and the proteasome. Cellular Microbiology. 10, 332-343 (2008).
- Franchi, L., Kanneganti, T. D., Dubyak, G. R., Nunez, G. Differential requirement of P2X7 receptor and intracellular K+ for caspase-1 activation induced by intracellular and extracellular bacteria. The Journal of Biological Chemistry. 282, 18810-18818 (2007).
- Owen, D. M., Gale, M. Fighting the flu with inflammasome signaling. Immunity. 30, 476-478 (2009).
- Pang, I. K., Iwasaki, A. Inflammasomes as mediators of immunity against influenza virus. Trends in Immunology. 32, 34-41 (2011).
- Kanneganti, T. D., et al. Critical role for Cryopyrin/Nalp3 in activation of caspase-1 in response to viral infection and double-stranded RNA. The Journal of Biological Chemistry. 281, 36560-36568 (2006).
- Ichinohe, T., Lee, H. K., Ogura, Y., Flavell, R., Iwasaki, A. Inflammasome recognition of influenza virus is essential for adaptive immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 206, 79-87 (2009).
- Ichinohe, T., Pang, I. K., Iwasaki, A. Influenza virus activates inflammasomes via its intracellular M2 ion channel. Nat Immunol. 11, 404-410 (2010).
- Ichinohe, T., et al. Microbiota regulates immune defense against respiratory tract influenza A virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5354-5359 (2011).
- O’Neill, D. W., Bhardwaj, N. Differentiation of peripheral blood monocytes into dendritic cells. Current Protocols in Immunology. 22, (2005).
- Sabado, R. L., Miller, E., Spadaccia, M., Vengco, I., Hasan, F., Bhardwaj, N. Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy. J. Vis. Exp. (78), (2013).
- Rubartelli, A., Cozzolino, F., Talio, M., Sitia, R. A novel secretory pathway for interleukin-1 beta, a protein lacking a signal sequence. The EMBO Journal. 9, 1503-1510 (1990).
- Ritchie, H., Booth, N. A. Secretion of plasminogen activator inhibitor 2 by human peripheral blood monocytes occurs via an endoplasmic reticulum-golgi-independent pathway. Experimental Cell Research. 242, 439-450 (1998).
- Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nature Protocols. 1, 1507-1516 (2006).
- He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques. J Vis Exp. 38, (2010).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of Medical Sciences. 4, 429-434 (2012).
- Alegria-Schaffer, A., Lodge, A., Vattem, K. Performing and optimizing Western blots with an emphasis on chemiluminescent detection. Methods in Enzymology. 463, 573-599 (2009).
- Hennet, T., Ziltener, H. J., Frei, K., Peterhans, E. A kinetic study of immune mediators in the lungs of mice infected with influenza A virus. J Immunol. 149, 932-939 (1992).
- Pirhonen, J., Sareneva, T., Kurimoto, M., Julkunen, I., Matikainen, S. Virus infection activates IL-1 beta and IL-18 production in human macrophages by a caspase-1-dependent pathway. J Immunol. 162, 7322-7329 (1999).
- Anderson, J., Gustafsson, K., Himoudi, N. Licensing of killer dendritic cells in mouse and humans: functional similarities between IKDC and human blood gammadelta T-lymphocytes. Journal of Immunotoxicology. 9, 259-266 (2012).
- Waithman, J., Mintern, J. D. Dendritic cells and influenza A virus infection. Virulence. 3, 603-608 (2012).
