Imaging dendritiske udløbere af Rat Primær hippocampusneuroner hjælp Structured Illumination Mikroskopi
Summary
Denne artikel beskriver en arbejdsgruppe protokol til billede dendritiske Torner fra hippocampus neuroner in vitro ved hjælp af Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-opløsning mikroskopi hjælp SIM giver billedopløsning betydeligt over den lys diffraktion grænse i alle tre rumlige dimensioner, så billeder af de enkelte dendritiske Torner med forbedret detalje.
Abstract
Dendritiske udløbere er fremspring nye fra dendritceller af en neuron og repræsenterer de primære postsynaptiske mål for excitatoriske input i hjernen. Teknologiske fremskridt har identificeret disse strukturer som centrale elementer i neuron tilslutningsmuligheder og synaptisk plasticitet. Den kvantitative analyse af rygsøjlen morfologi ved hjælp af lys mikroskopi fortsat er en vigtig problem på grund af tekniske begrænsninger, der er forbundet med lys iboende brydning grænse. Dendritiske udløbere kan let identificeres ved konfokal laser-scanning fluorescensmikroskopi. Men måle små ændringer i form og størrelse af pigge er vanskelig, fordi andre end længden rygsøjlen dimensioner er normalt mindre end konventionel optisk opløsning fastsættes ved lysmikroskopi teoretiske opløsning på 200 nm.
Adskillige nyligt udviklede super opløsning teknikker er blevet brugt til billede cellulære strukturer mindre end 200 nm, herunder dendritiske pigge. Tisse teknikker er baseret på klassiske langt operationer i felten og dermed tillade brug af eksisterende prøveforberedelse metoder og at billedet ud over overfladen af en prøve. Beskrevet her er en arbejdsgruppe protokol at anvende super opløsning struktureret belysning mikroskopi (SIM) til billeddannelse af dendritiske Torner i primær hippocampus neuron kulturer. Mulige anvendelser af SIM overlapper konfokal mikroskopi. De to teknikker præsentere forskellige anvendelighed. SIM tilbyder højere effektiv lateral opløsning, mens konfokal mikroskopi, på grund af brugen af et fysisk hul, opnår resolution forbedring på bekostning af fjernelse af ud af fokus lys. I denne protokol, primære neuroner dyrkes på dækglas ved hjælp af en standard-protokol, transficeret med DNA-plasmider, der koder for fluorescerende proteiner og filmede med SIM. Hele protokollen beskrevet heri tager omkring 2 uger, fordi dendritiske spidser afbildes efter 16-17 dage in vitro, nårdendritiske udvikling er optimal. Efter færdiggørelsen af protokollen, kan dendritiske Torner rekonstrueres i 3D fra serier af SIM billedstakke hjælp af specialiseret software.
Introduction
En dendritiske er et lille fremspring i neuron membran. Denne karakteristiske struktur er specialiseret til at typisk modtage input fra en enkelt synapse og repræsenterer den fysiske kontakt området mellem to neuroner. De fleste funktionelt modne dendritiske spidser består af en kugleformet spids, betegnet hoved og en tynd hals, der forbinder hovedet til dendritiske akslen. Men spines er ikke statiske og flytte og ændre deres morfologi kontinuerligt, selv i den voksne hjerne 2 aktivt. Inden for en 2 ugers periode af tid, rotte primære hippocampus neuron kulturer stammer fra slutningen af embryonale eller tidlig postnatal tid udvikle komplekse dendritiske dorne med mange membran fremspring, der udvikler sig fra tidlig filipodia til rygsøjlen-lignende strukturer 3. Baseret på denne dynamiske egenskaber og andre egenskaber, er dendritiske spidser antages at tilvejebringe en anatomisk substrat for hukommelse opbevaring og synaptisk transmission 4,5.
I betragtning af the afgørende rolle at dendritiske rygsøjlen størrelse og form har i synaptisk funktion, er det vigtigt at måle deres dimensioner præcist. Spines varierer fra omkring 200 til 2000 nanometer i længden og kan let identificeres ved konfokal laser-scanning fluorescensmikroskopi. Men andre end længden rygsøjlen dimensioner er normalt under de konventionelle optiske systemer resolution teoretisk fastsættes af diffraktion omkring 200 nanometer 6. Disse løse beføjelser er utilstrækkelige til billeddannelse finere detaljer, såsom bredden af rygsøjlen halse og hoveder. Meget arbejde har været dedikeret til at løse dette problem, og mange relativt nye super-opløsning mikroskopi teknikker har givet betydelige fremskridt. I særdeleshed er det muligt at opnå opløsning end den klassiske grænse uden at kassere enhver emission lys ved hjælp af sideværts struktureret belysning mikroskopi (SIM) i et bredt felt, ikke-konfokalt mikroskop 7-10. Ved at bruge denne teknik i kombination med non-linear mikroskopi teknikker, er det teoretisk muligt at forbedre lateral opløsning af det optiske mikroskop af et ubegrænset faktor 11. I de fleste eksperimentelle omstændigheder SIM tillader dog overgå grænsen opløsning med en faktor to 1. Andre super-opløsning optisk mikroskopi teknikker såsom stimuleret emission depletion (STED) mikroskopi 12 og foto-aktivering lokalisering mikroskopi (PALM) 12 er blevet anvendt på billeddannelse af dendritiske Torner. Localization-baserede metoder, såsom PALM kræver meget store mængder af rå billeder for at opnå super-opløsning og er derfor begrænset i hastighed. På den anden side, kan STED opnå en høj billedbehandling hastighed, selv ved relativt lave fotontælninger og små synsfelter, hvilket måske ikke er tilfældet for SIM 13.
I denne artikel er det målet at give en arbejdsgruppe protokol til billede dendritiske Torner fra rotte primære hippocampus neuroner dyrket in vitro </em> bruge SIM. Protokollen består af to skelnes faser: en indledende ene bestående af etablering, udvikling, transfektion og immunhistokemi af rotte primære hippocampus neuron kulturer og en sen fase dedikeret til at prøve billeddannelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikel en arbejdsgruppe protokol til billede dendritiske Torner fra rotte primære hippocampus neuroner dyrket in vitro ved hjælp af SIM beskrives. Den primære hippocampale neuroner dyrkningsmetode er en tilpasning af den oprindelige metode beskrevet af Kaech og Banker 18. De væsentligste forskelle er brugen af Neurobasal/B27 dyrkningsmedium, hvilket fjerner kravet om astrogliale feeder kulturer, og tilføjelsen af den mitotiske inhibitor FUDR på dag 3 som fremmer neuronal overlevelse me…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af en VIDI tilskud nummer H64.09.016 fra Holland Organisation for Videnskabelig Forskning (NWO) til CPF. CPF er taknemmelig til Dr. Silvina A. Fratantoni for hendes kritiske kommentarer og rettelser til den endelige manuskript. GMRDL / emmm understøttes af den hollandske Højteknologifonden STW (projekt 12151 og 11350), som er en del af NWO, og som er delvist finansieret af Økonomiministeriet. Vi takker Catherine Kitts og Peter Drent af Nikon Instruments Europe BV for hjælp og støtte. HX blev støttet af Royal Dutch Academy of Arts and Sciences (tilskud 11CDP10) og WT blev støttet af tilskud Nederlandenes organisation for videnskabelig forskning (tilskud 820.02.006).
Materials
| Fine forceps | |||
| Big forceps | |||
| Fine scissor | |||
| Big scissor | |||
| Blunt spatula | |||
| Dissecting microscope with illumination | |||
| Light microscope | |||
| 37 °C water bath | |||
| Laminar flow cell culture hood | |||
| High-temperature dry-oven | |||
| Bunsen burner | |||
| Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C) | |||
| Microcentrifuge | |||
| Orbital shaker | |||
| Nikon structured illumination microscope setup consisting of: | |||
| Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System | |||
| Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49) | |||
| 4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength) | |||
| SIM Illuminator | |||
| Nikon Stage Controller | |||
| MCL Nano-Drive piezo controller | |||
| Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp | |||
| SIM Microscope Enclosure temperature control | |||
| Andor EM-CCD Camera iXon DU897 | |||
| PC with Microsoft Windows 7 Home Edition | |||
| Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package | |||
| Nikon type A immersion oil |
Referencias
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microsc. 198, 82-87 (2000).
- Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Curr Opin Neurobiol. 19, 146-153 (2009).
- Dailey, M. E., Smith, S. J. The dynamics of dendritic structure in developing hippocampal slices. J Neurosci. 16, 2983-2994 (1996).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).
- Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61, 85-100 (2009).
- Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9, 413-418 .
- Gustafsson, M. G., Agard, D. A., Sedat, J. W. I5M: 3D widefield light microscopy with better than 100 nm axial resolution. J Microsc. 195, 10-16 (1999).
- Heintzmann, R., Cremer, C. G. Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating. Proc. SPIE 3568 Optical Biopsies and Microscopic Techniques III. , 185-196 (1999).
- Karadaglić, D., Wilson, T. Image formation in structured illumination wide-field fluorescence microscopy. Micron. 39, 808-818 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320, 1332-1336 (2008).
- Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13081-13086 (2005).
- Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 18982-18987 (2008).
- Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat Methods. 6, 339-342 (2009).
- James, C. D., et al. Aligned microcontact printing of micrometer-scale poly-L-lysine structures for controlled growth of cultured neurons on planar microelectrode arrays. IEEE Trans Biomed Eng. 47, 17-21 (2000).
- Dumitriu, D., Rodriguez, A., Morrison, J. H. High-throughput, detailed, cell-specific neuroanatomy of dendritic spines using microinjection and confocal microscopy. Nat Protoc. 6, 1391-1411 (2011).
- Fitzsimons, C. P., et al. Knockdown of the glucocorticoid receptor alters functional integration of newborn neurons in the adult hippocampus and impairs fear-motivated behavior. Mol Psychiatry. , (2012).
- van Hooijdonk, L. W., et al. Lentivirus-mediated transgene delivery to the hippocampus reveals sub-field specific differences in expression. BMC Neurosci. , (2009).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Izeddin, I., et al. Super-resolution dynamic imaging of dendritic spines using a low-affinity photoconvertible actin probe. PLoS ONE. 6, (2011).
