Beeldvorming Dendritische stekels van Rat Primaire hippocampus neuronen met behulp van Structured Illumination Microscopie
Summary
Dit artikel beschrijft een werkprotocol op de foto dendritische stekels van hippocampale neuronen in vitro met behulp van Structured Illumination Microscopy (SIM). Superresolutietechnieken gebruik van SIM biedt beeldresolutie aanzienlijk verder gaan dan het licht limiet diffractie in alle drie ruimtelijke dimensies, waardoor de beeldvorming van individuele vertakte stekels met verbeterde details.
Abstract
Dendritische uitsteeksels die uit de dendriet van een neuron en vormen de voornaamste doelwitten van prikkelende postsynaptische inputs in de hersenen. Technologische ontwikkelingen hebben deze structuren geïdentificeerd als de belangrijkste elementen in neuron connectiviteit en synaptische plasticiteit. De kwantitatieve analyse van de wervelkolom morfologie met behulp van licht microscopie blijft een essentieel probleem te wijten aan technische beperkingen in verband met intrinsieke breking limiet licht's. Vertakte stekels kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd door confocale laser scanning fluorescentie microscopie. Echter, het meten van subtiele veranderingen in de vorm en grootte van stekels is moeilijk omdat dan lengte ruggengraat afmetingen zijn meestal kleiner dan conventionele optische resolutie van de theoretische resolutie limiet van 200 nm lichtmicroscopie is vastgesteld.
Verschillende recent ontwikkelde super resolutie technieken zijn gebruikt om het cellulaire structuren kleiner dan 200 nm, met inbegrip van vertakte stekels. Teze technieken zijn gebaseerd op klassieke ver-acties in het veld en het dus mogelijk het gebruik van bestaande monster bereidingswijzen en imago voorbij de oppervlakte van een monster. Hier beschreven is een werkprotocol om super resolutie gestructureerde verlichting microscopie (SIM) van toepassing zijn op de beeldvorming van vertakte stekels in primaire hippocampus neuron culturen. Mogelijke toepassingen van SIM overlappen met die van confocale microscopie. De twee technieken met uiteenlopende toepasbaarheid. SIM biedt hogere effectieve laterale resolutie, terwijl de confocale microscopie, als gevolg van het gebruik van een fysieke pinhole, realiseert verbetering resolutie ten koste van de verwijdering van onscherp licht. In dit protocol primaire neuronen gekweekt op dekglaasjes gebruik van een standaard protocol, getransfecteerd met DNA plasmiden die fluorescerende eiwitten en afgebeeld met SIM. Het hele protocol hierin beschreven duurt ongeveer 2 weken, omdat dendritische stekels worden afgebeeld na 16-17 dagen in vitro, wanneerdendritische ontwikkeling optimaal. Na voltooiing van het protocol, kan vertakte stekels worden gereconstrueerd in 3D uit serie van SIM image stacks met behulp van gespecialiseerde software.
Introduction
Een dendritisch wervelkolom is een klein uitsteeksel van het neuron membraan. Dit karakteristieke structuur is gespecialiseerd in typisch ontvangen input van een enkele synaps en vertegenwoordigt het fysieke contact tussen twee neuronen. Meest functioneel mature dendritische uitsteeksels bestaan uit een bolvormige tip, genoemd hoofd, en een dunne nek die het hoofd verbindt met de dendritische as. Echter, stekels zijn niet statisch en actief bewegen en voortdurend veranderen hun morfologie, zelfs in de volwassen hersenen 2. Binnen een periode van 2 weken tijd, rat primaire hippocampus neuron culturen afkomstig van late embryonale of vroege postnatale tijd ontwikkelen complex dendritische priëlen met tal membraan uitsteeksels die evolueren van vroege filipodia tot wervelkolom-achtige structuren 3. Op basis van deze dynamische gedrag en andere kenmerken, dendritische gedacht dat een anatomisch substraat voor geheugenopslag en synaptische transmissie 4,5 verschaffen.
Gezien the cruciale rol die dendritische spine grootte en vorm hebben in synaptische functie, is het belangrijk om de afmetingen te meten. Stekels variëren van ongeveer 200 tot 2000 nanometer lang en kan gemakkelijk worden geïdentificeerd door confocale laser scanning fluorescentie microscopie. Echter, andere dan lengte wervelkolom afmetingen zijn meestal onder de conventionele optische systemen 'resolutie, theoretisch vastgesteld door diffractie rond 200 nanometer 6. Deze oplossing van bevoegdheden ontoereikend zijn voor de beeldvorming van fijnere details, zoals de breedte van de wervelkolom nek en hoofd. Veel werk is gewijd aan dit probleem op te lossen en veel relatief nieuwe super-resolutie microscopie technieken hebben aanzienlijke vooruitgang verstrekt. Met name is het mogelijk de resolutie dan de klassieke limiet bereiken zonder waarbij een eventueel emissielicht met zijdelings gestructureerde verlichting microscopie (SIM) in een breed gebied, niet-confocale microscoop 7-10. Met deze techniek in combinatie met niet-linear microscopische technieken, is het theoretisch mogelijk om de laterale resolutie van de optische microscoop te verbeteren door een algemene factor 11. In de meeste experimentele omstandigheden SIM kan de resolutiegrens met een factor twee 1 overtreffen. Andere super-resolutie optische microscopie technieken zoals stimulated emission depletion (STED) microscopie 12 en foto-activering lokalisatie microscopie (PALM) 12 zijn toegepast op beeldvorming van dendritische stekels. Lokalisatie-gebaseerde werkwijzen zoals PALM vereisen zeer grote aantallen onbewerkte afbeeldingen super-resolutie te bereiken en daarom snelheid beperkt. Anderzijds kan STED hoge imaging snelheid te bereiken, maar bij relatief lage fotontellingen en kleine gezichtsveld, wat niet het geval voor SIM 13 kan zijn.
In dit artikel is het doel om een werkprotocol te verstrekken aan het vertakte stekels van de rat primaire hippocampale neuronen in vitro gekweekte </em> het gebruik van SIM. Het protocol bestaat uit twee onderscheiden fasen: een eerste een bestaande vestiging, ontwikkeling, transfectie en immunohistochemie van rat primaire hippocampus neuron culturen en een late fase gewijd aan de beeldvorming te proeven.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel een werkprotocol op de foto dendritische stekels van de rat primaire hippocampale neuronen gekweekt in vitro gebruik van SIM wordt beschreven. De primaire hippocampale neuron cultuur methode is een aanpassing van de oorspronkelijke methode beschreven door Kaech en Banker 18. De belangrijkste verschillen zijn het gebruik van Neurobasal/B27 kweekmedium, waardoor de eis van astrogliale feeder culturen elimineert, en de toevoeging van de mitotische remmer FUDR op dag 3 welke neuronale over…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door een VIDI subsidie aantal H64.09.016 uit Nederland Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO) naar CPF. CPF is dankbaar voor Dr Silvina A. Fratantoni voor haar kritische commentaar en correcties op de definitieve manuscript. GMRDL / emmm worden ondersteund door de Nederlandse Technologiestichting STW (project 12151 en 11350), dat deel uitmaakt van het NWO, en dat wordt mede gefinancierd door het Ministerie van Economische Zaken. Wij danken de Catherine Kitts en Peter Drent van Nikon Instruments Europe BV voor hulp en ondersteuning. HX werd ondersteund door de Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen (subsidie 11CDP10) en WT werd ondersteund door subsidie van Nederland Organisatie voor Wetenschappelijk onderzoek (subsidie 820.02.006).
Materials
| Fine forceps | |||
| Big forceps | |||
| Fine scissor | |||
| Big scissor | |||
| Blunt spatula | |||
| Dissecting microscope with illumination | |||
| Light microscope | |||
| 37 °C water bath | |||
| Laminar flow cell culture hood | |||
| High-temperature dry-oven | |||
| Bunsen burner | |||
| Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C) | |||
| Microcentrifuge | |||
| Orbital shaker | |||
| Nikon structured illumination microscope setup consisting of: | |||
| Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System | |||
| Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49) | |||
| 4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength) | |||
| SIM Illuminator | |||
| Nikon Stage Controller | |||
| MCL Nano-Drive piezo controller | |||
| Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp | |||
| SIM Microscope Enclosure temperature control | |||
| Andor EM-CCD Camera iXon DU897 | |||
| PC with Microsoft Windows 7 Home Edition | |||
| Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package | |||
| Nikon type A immersion oil |
Referencias
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microsc. 198, 82-87 (2000).
- Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Curr Opin Neurobiol. 19, 146-153 (2009).
- Dailey, M. E., Smith, S. J. The dynamics of dendritic structure in developing hippocampal slices. J Neurosci. 16, 2983-2994 (1996).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).
- Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61, 85-100 (2009).
- Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9, 413-418 .
- Gustafsson, M. G., Agard, D. A., Sedat, J. W. I5M: 3D widefield light microscopy with better than 100 nm axial resolution. J Microsc. 195, 10-16 (1999).
- Heintzmann, R., Cremer, C. G. Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating. Proc. SPIE 3568 Optical Biopsies and Microscopic Techniques III. , 185-196 (1999).
- Karadaglić, D., Wilson, T. Image formation in structured illumination wide-field fluorescence microscopy. Micron. 39, 808-818 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320, 1332-1336 (2008).
- Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13081-13086 (2005).
- Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 18982-18987 (2008).
- Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat Methods. 6, 339-342 (2009).
- James, C. D., et al. Aligned microcontact printing of micrometer-scale poly-L-lysine structures for controlled growth of cultured neurons on planar microelectrode arrays. IEEE Trans Biomed Eng. 47, 17-21 (2000).
- Dumitriu, D., Rodriguez, A., Morrison, J. H. High-throughput, detailed, cell-specific neuroanatomy of dendritic spines using microinjection and confocal microscopy. Nat Protoc. 6, 1391-1411 (2011).
- Fitzsimons, C. P., et al. Knockdown of the glucocorticoid receptor alters functional integration of newborn neurons in the adult hippocampus and impairs fear-motivated behavior. Mol Psychiatry. , (2012).
- van Hooijdonk, L. W., et al. Lentivirus-mediated transgene delivery to the hippocampus reveals sub-field specific differences in expression. BMC Neurosci. , (2009).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Izeddin, I., et al. Super-resolution dynamic imaging of dendritic spines using a low-affinity photoconvertible actin probe. PLoS ONE. 6, (2011).
