الدماغ شريحة Biotinylation: و<em> فيفو السابقين</em> النهج لقياس منطقة محددة بلازما بروتين غشاء الاتجار الكبار الخلايا العصبية
Summary
الاتجار غشاء الخلايا العصبية تسيطر بشكل حيوي غشاء البلازما توافر البروتين والآثار بشكل كبير العصبي. حتى الآن، فقد كان تحدي لقياس الاتجار التقامي العصبية في الخلايا العصبية الكبار. هنا، نحن تصف أو أسلوب الكمي فعالة للغاية لقياس التغيرات السريعة في سطح بروتين تعبير فيفو السابقين في شرائح الدماغ الحادة.
Abstract
الاتجار التقامي ينظم هو الآلية المركزية تسهيل مجموعة متنوعة من الأحداث neuromodulatory، من خلال السيطرة على مستقبلات حيوي، القناة الايونية، ونقل الخلايا السطحية العرض على نطاق والوقت دقيقة. هناك تنوع واسع من الآليات التي تتحكم في الاتجار التقامي من البروتينات الفردية. وقد اعتمدت الدراسات التحقيق في الأسس الجزيئية للاتجار في المقام الأول على سطح biotinylation لقياس كميا التغيرات في غشاء البروتين التعبير سطح استجابة للمؤثرات الخارجية والتلاعب الجيني. ومع ذلك، فقد تم هذا النهج تقتصر أساسا على الخلايا المستزرعة، والتي قد لا تعكس بأمانة الآليات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في اللعب في الخلايا العصبية الكبار. وعلاوة على ذلك، قد نهج خلايا مستنبتة نقلل الاختلافات الخاصة بكل منطقة في آليات الاتجار. هنا، نحن تصف النهج الذي يمتد biotinylation سطح الخلية إلى إعداد شريحة حاد في الدماغ. نحنإثبات أن هذا الأسلوب يوفر نهجا عالية الدقة لقياس التغيرات السريعة في مستويات سطح بروتين الغشاء في الخلايا العصبية الكبار. هذا النهج من المرجح أن يكون أداة واسعة في مجال الاتجار التقامي العصبية.
Introduction
الاتجار التقامي هو آلية الخلوية في كل مكان أن غرامة الإيقاعات العرض غشاء البلازما من مجموعة متنوعة من البروتينات الغشاء لا يتجزأ. الإلتقام يسلم المواد الغذائية الحيوية إلى الخلايا الوسط 1 وتبلد مستقبلات الإشارات ردا على تنشيط مستقبلات 2. يمكن إعادة تدوير التقامي العودة إلى غشاء البلازما بالإضافة إلى تعزيز الإشارات الخلوية من خلال زيادة مستويات البروتين التعبير على سطح الخلية 3. علاوة على ذلك، وتورط الاضطرابات الاتجار الغشاء في العديد من الأمراض والحالات المرضية 4،5، مشددا على ضرورة التحقيق في الآليات الجزيئية التي تتحكم البروتين الاتجار التقامي. بينما العديد من البروتينات الاستفادة من آليات استيعاب الكلاسيكية التي تعتمد على بالكلاذرين، أدلة متزايدة على مدى السنوات القليلة الماضية يدل على أن آليات بالكلاذرين مستقلة متعددة التقامي تحكم المحتملة التقامي من مجموعة متزايدة منالبروتينات 6،7. وبالتالي، نمت الحاجة إلى آليات التحقيق التقامي تسهيل الاتجار في النظم الفسيولوجية ذات الصلة إلى حد كبير.
في الدماغ، والاتجار التقامي من المستقبلات، وقنوات ايون والنقل العصبي له دور أساسي في إنشاء اللدونة متشابك 8-11 وردا على تعاطي المخدرات 12-15، مما يؤثر في النهاية استثارة الخلايا العصبية واستجابات متشابك. حتى الآن معظم الدراسات الاتجار العصبية تعتمد على إما أنظمة تعبير مغايرة أو الخلايا العصبية الأولية مثقف، لا هذا ولا ذاك والتي قد تعكس بشكل موثوق آليات في اللعب في الخلايا العصبية الكبار. هنا، ونحن التقرير النهج الذي يستخدم سطح biotinylation لقياس كميا مستويات البروتين السطح في شرائح الدماغ الحادة المستمدة من القوارض الكبار. باستخدام هذا النهج، فإننا نقدم البيانات التي تثبت أن نقل الدوبامين الجسم المخطط الماوس internalizes بسرعة في إعادةsponse بأن phorbol بوساطة استر بروتين كيناز C (PKC) التنشيط.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من المعرفة منذ وقت طويل أن الاتجار التقامي خطيرة الآثار إشارات متشابك في الدماغ، وقد ثبت صعوبة في قياس كميا التغيرات في تعبير البروتين في الخلايا العصبية سطح الكبار. في هذا العمل، ونحن التقرير نهجا يمكن الاعتماد عليها لتسمية بروتين السطح فيفو السابقين</em…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح DA15169 وDA035224 إلى HEM
Materials
| sulfo NHS-SS-biotin | Pierce | 21331 | |
| Streptavidin agarose | Pierce | 20347 | |
| IgG-free, Protease-free Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | |
| Vibrating microtome sectioner | Various | ||
| Shaking water bath | various | ||
| Milli-cell mesh-bottomed inserts (8µm pore size) | Millipore | PI8P 012 50 | These can be washed by hand and re-used |
Referencias
- Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
- Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Leto, D., Saltiel, A. R. Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 383-396 (2012).
- Liu, Y. W., Lukiyanchuk, V., Schmid, S. L. Common membrane trafficking defects of disease-associated dynamin 2 mutations. Traffic. 12, 1620-1633 (2011).
- Li, X., DiFiglia, M. The recycling endosome and its role in neurological disorders. Prog. Neurobiol. , 127-141 (2012).
- Sandvig, K., Pust, S., Skotland, T., van Deurs, B. Clathrin-independent endocytosis: mechanisms and function. Curr. Opin. Cell Biol. 23, 413-420 (2011).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Res. 20, 256-275 (2010).
- Barry, M. F., Ziff, E. B. Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 279-286 (2002).
- Bredt, D. S., Nicoll, R. A. AMPA receptor trafficking at excitatory synapses. Neuron. 40, 361-379 (2003).
- Kerchner, G. A., Nicoll, R. A. Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP. Nat. Rev. Neurosci. 9, 813-825 (2008).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).
- Borgland, S. L., Malenka, R. C., Bonci, A. Acute and chronic cocaine-induced potentiation of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral correlates in individual rats. J. Neurosci. 24, 7482-7490 (2004).
- Dong, Y., et al. Cocaine-induced potentiation of synaptic strength in dopamine neurons: Behavioral correlates in GluRA(-/-) mice. PNAS. 101, 14282-14287 (2004).
- Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annu. Rev. Neurosci. 29, 565-598 (2006).
- Thomas, M. J., Malenka, R. C. Synaptic plasticity in the mesolimbic dopamine system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, 815-819 (2003).
- Sorkina, T., Hoover, B. R., Zahniser, N. R., Sorkin, A. Constitutive and protein kinase C-induced internalization of the dopamine transporter is mediated by a clathrin-dependent mechanism. Traffic. 6, 157-170 (2005).
- Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat. Neurosci. 8, 881-888 (2005).
- Loder, M. K., Melikian, H. E. The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines. J. Biol. Chem. 278, 22168-22174 (2003).
- Melikian, H. E., Buckley, K. M. Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter. J. Neurosci. 19, 7699-7710 (1999).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters. J. Biol. Chem. 274, 35794-35801 (1999).
- Sorkina, T., et al. RNA interference screen reveals an essential role of Nedd4-2 in dopamine transporter ubiquitination and endocytosis. J. Neurosci. 26, 8195-8205 (2006).
- Eriksen, J., et al. Visualization of dopamine transporter trafficking in live neurons by use of fluorescent cocaine analogs. J. Neurosci. 29, 6794-6808 (2009).
- Rao, A., Simmons, D., Sorkin, A. Differential subcellular distribution of endosomal compartments and the dopamine transporter in dopaminergic neurons. Mol. Cell Neurosci. 46, 148-158 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-752 (2011).
