In vivo optische beeldvorming van hersentumoren en artritis met fluorescerende SAPC-DOPS nanovesicles
Summary
We beschrijven een multi-angle rotatie optische beeldvorming (Maroi) systeem voor in vivo kwantificatie van een fluorescerende marker door saposine C (SAPC)-dioleoylfosfatidylserine (DOPS) nanovesicles geleverd. Gebruikmakend muismodellen van kanker en artritis, laten we zien hoe de Maroi signaalverloop analyse kan worden gebruikt voor een nauwkeurige kartering en biologische karakterisering van ziekteprocessen.
Abstract
We beschrijven een multi-angle rotatie optische beeldvorming (Maroi) systeem voor in vivo opvolging van pathofysiologische processen gelabeld met een fluorescente marker. Muismodellen (hersentumor en artritis) werden gebruikt om de bruikbaarheid van deze methode te evalueren. Saposine C (SAPC)-dioleoylfosfatidylserine (DOPS) nanovesicles getagd met CellVue Maroon (CVM) fluorofoor werden intraveneus toegediend. Dieren werden vervolgens in de roterende houder (MARS) van de in vivo imaging systeem. Beelden werden in 10 ° stappen verworven meer dan 380 °. Een rechthoekige regio van belang (ROI) werd over de volle breedte afbeelding geplaatst op de modelziekte website. Binnen de ROI, en voor elk beeld, werd de gemiddelde fluorescentie-intensiteit berekend mits achtergrond aftrek. In de muismodellen onderzocht werden de gemerkte nanovesicles opgenomen in zowel de orthotope en transgene hersentumoren, en de artritische plekken (tenen en enkels). Curve analyse van de multi angle image ROI bepaald de hoek met het sterkste signaal. Zo is de optimale hoek voor beeldvorming elke ziekte plaats werd gekarakteriseerd. De Maroi toegepast op beeldvorming van fluorescente verbindingen is een niet-invasieve, economische en nauwkeurig hulpmiddel in vivo kwantitatieve analyse van de ziektetoestanden beschreven muismodellen.
Introduction
Hele dier beeldvorming is uitgegroeid tot een krachtig hulpmiddel in de studie van dierlijke fysiopathologie. Onder de huidige beeldvormende systemen, de MS FX PRO stelt onderzoekers in staat om nauwkeurig te visualiseren fluorescent gelabelde (of lichtgevende) verbindingen en / of weefsels in levende muizen, en tegelijkertijd krijgen röntgenbeelden. Met de onlangs geïntroduceerde multimodale rotatie dierlijke (MARS) volledig geautomatiseerde rotatie van de muis wordt bereikt om zowel fluorescerend / luminescente en röntgenbeelden op specifieke hoeken vastleggen 1. Beeldacquisitie kan zodanig zijn dat opeenvolgende reeks beelden kunnen worden vastgelegd op specifieke, incrementele hoeken zo klein als 1 ° worden geprogrammeerd. Hierdoor kan men de optimale oriëntatie van het dier, dat wil zeggen identificeren. waarin de afstand tussen de intern gegenereerde fluorescent / luminescent signaal en detectie-inrichting van het systeem is de kortste. Dit op zijn beurt maakt nauwkeurige herpositionering van het dier voor verdere beeldvorming sessions tijdens longitudinale studies.
In dit rapport beschrijven we de implementatie van een multi-angle rotatie optische beeldvorming (Maroi) systeem voor in vivo kwantificatie van fluorescente marker intensiteit. Maroi signaalverloop analyse kan worden gebruikt in longitudinale studies directe correlatie van fluorescentiesignaal verdeling nauwkeurig in kaart zieke sites of biologische processen plaats.
Dit systeem werd gebruikt voor het bewaken van de absorptie van fluorescent gelabelde SAPC-DOPS nanovesicles door orthotope en spontane tumoren, alsmede door artritis foci in levende muizen; verstrekte multispectrale en multimodale datasets afkomstig van volledige rotatie dekking van de dieren. Onder de talrijke fluorescente probes beschikbaar voor in vivo beeldvorming, die emitteren in het nabije infrarood en ver-rode spectrale gebieden verlenen de laagste interferentie met de huid en weefsels, en bieden de hoogste penetratie en het resolution. We gebruikten CellVue Maroon (CVM) 2,3, een ver-rood fluorescerende cel linker (Ex 647/Em 667), om SAPC-DOPS (SAPC-DOPS-CVM) 4-12 labelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nauwkeurige bepaling van de locatie en de omvang van solide tumoren en inflammatoire foci bij reumatische aandoeningen is van cruciaal belang om een adequate behandeling te implementeren en opvolgen ziekteprogressie of kwijtschelding. Terwijl waardevolle, de huidige grafische strategieën (X-stralen, MRI, echografie, X-ray tomografie) onvolledige beoordeling van de status van de ziekte. Zo wordt artritis gewrichtsschade gewoonlijk bepaald door X-stralen, die gegevens over botstructuur maar niet op zacht weefsel ontsteking en vernietiging, kenmerkend vroege stadia van de ziekte bepaalt. De Maroi hier gepresenteerde methode combineert de voordelen van zowel röntgenstraling en verfijnde zachte weefsel beeldvormende modaliteiten (bijv. MRI of echografie) een geïntegreerde, niet-invasieve en eenvoudigere platform dat ook zorgt voor een volledige 3D mapping en reconstructie van het zieke weefsel of orgaan in kleine dieren zoals muizen.
Deze methode maakt gebruik van de selectieve affiniteit of SAPC-DOPS nanovesicles voor blootgestelde fosfatidylserine residuen, die overvloedig in de membranen van kanker en inflammatoire cellen. De determinant van deze binding is SAPC, een fusogene lysosomale eiwit met een sterke affiniteit voor anionische fosfolipiden zoals fosfatidylserine 7,10,11. Wanneer geconjugeerd aan een fluorescente probe (CVM), kunnen systemisch geïnjecteerd SAPC-DOPS naar tumor en artritis locaties worden opgespoord door fluorescentie beeldvorming.
Beperkingen van onze methode zijn gerelateerd aan de gevoeligheid, die op dit moment beperkt het gebruik ervan tot beeldvorming van kleine dieren zoals muizen. Zoals met andere beeldvormende werkwijzen wordt optimaal fluorescent signaal ruisverhouding beperkt door de grootte van de tumor of de omvang van artritis en kunnen gecompromitteerd bij beeldvorming weefsels of organen met een hoge achtergrond (autofluorescentie) zoals oren (brain imaging), darmen / feces (abdominale beeldvorming) en poten (achterste ledematen imaging). Daarbij vonden we dat een ver-rode kleurstof zoals CVM probepaalt betere spectrale scheiding en oplossing de de in vivo omgeving dan andere fluorescerende probes in het zichtbare gebied.
Andere valkuilen zijn onder potentiële beweging van het dier tijdens de beeldvorming, zowel tijdens narcose en post mortem (rigor mortis). Achterste ledematen positionering, bijzonder vaak moeilijk te stabiliseren beweging tijdens rotatie te voorkomen. In de huidige staat van de techniek is ook tijdrovend, met scan keer zo lang als 60 minuten nodig om een volledige omwenteling te voltooien en het verwerven van beelden van hoge kwaliteit.
De Maroi methode biedt een aantal voordelen ten opzichte van andere beeldvormende modaliteiten. De mogelijkheid om het zieke weefsel van 38 (of meer) verschillende hoeken maakt visualisatie van de fluorescentie die wordt belemmerd bij de beoordeling uit een enkel vlak; Dit is waardevol in dierstudies omdat het kan helpen verminderen het aantal valse negatieven als gevolg van beeldvorming op ongepaste hoeken. Door overdrukying röntgen en fluorescentiebeelden, kan een nauwkeurige anatomische lokalisatie van de zieke plaats worden bepaald. Tenslotte, de mogelijkheid van levende (in vivo) beeldvorming maakt longitudinale onderzoek wordt uitgevoerd.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd mede ondersteund door NIH / NCI Grants nummer 1R01CA158372-01 (Qi) en New Drug State Key Project Grant Number 009ZX09102-205 (Qi). Het schrijven van hulp werd geboden door Dr Judy Racadio, en werd gefinancierd door de Universiteit van Cincinnati Afdeling Hematologie en Oncologie. Vontz Core Imaging Lab (VCIL) in het College of Medicine van de Universiteit van Cincinnati.
Materials
| Dulbecco's modified eagle medium | Gibco (Grand Island, NY) | 11965 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco (Grand Island, NY) | 16000077 | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone (Logan, Utah) | SV30010 | |
| Dioleoylphosphatidylserine | Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL) | 840035C | |
| CellVue Maroon | Molecular Targeting Technologies, Inc. (Exton, PA) | C-1001 | |
| Sephadex G25 column PD-10 | Amersham Pharmacia Biotech, (Piscataway, NJ) | 17-0851-01 | |
| New Standard Stereotaxic for Rats and Mice | Harvard Apparatus (Holliston, MA) | 726335 | |
| Bransonic Ultrasonic Cleaners Model 1510 | Branson Ultrasonics (Danbury,CT) | CPN-952-118 | |
| Multi-spectral FX system | Bruker Corporation (Billerica, MA) | ||
| Multi-angle Rotational Optical Imaging Device | Bruker Corporation (Billerica, MA) |
Referencias
- Pizzonia, J., et al. Multimodality animal rotation imaging system (Mars) for in vivo detection of intraperitoneal tumors. Am J Reprod Immunol. 67, 84-90 (2012).
- Al-Mehdi, A. B., et al. Increased depth of cellular imaging in the intact lung using far-red and near-infrared fluorescent probes. Int J Biomed Imaging. , (2006).
- Gertner-Dardenne, J., et al. Lipophilic fluorochrome trackers of membrane transfers between immune cells. Immunol Invest. 36, 665-685 (2007).
- Qi, X., et al. Functional human saposins expressed in Escherichia coli. Evidence for binding and activation properties of saposins C with acid beta-glucosidase. J Biol Chem. 269, 16746-16753 (1994).
- Wang, Y., Grabowski, G. A., Qi, X. Phospholipid vesicle fusion induced by saposin. C. Arch Biochem Biophys. 415, 43-53 (2003).
- Qi, X., Chu, Z. Fusogenic domain and lysines in saposin. C. Arch Biochem Biophys. 424, 210-218 (2004).
- Qi, X., et al. Cancer-selective targeting and cytotoxicity by liposomal-coupled lysosomal saposin C protein. Clin Cancer Res. 15, 5840-5851 (2009).
- Kaimal, V., et al. Saposin C coupled lipid nanovesicles enable cancer-selective optical and magnetic resonance imaging. Mol Imaging Biol. 13, 886-897 (2011).
- Lu, K., et al. Toll-like receptor 4 can recognize SapC-DOPS to stimulate macrophages to express several cytokines. Inflamm Res. 60, 153-161 (2011).
- Qi, X., et al. Saposin C coupled lipid nanovesicles specifically target arthritic mouse joints for optical imaging of disease severity. PLoS One. 7, (2012).
- Abu-Baker, S., Chu, Z., Stevens, A. M., Li, J., Qi, X. Cytotoxicity and selectivity in skin cancer by SapC-DOPS nanovesicles. Journal of Cancer Therapy. 3, 321-326 (2012).
- Wojton, J., et al. Systemic delivery of SapC-DOPS has antiangiogenic and antitumor effects against glioblastoma. Mol Ther. 21, 1517-1525 (2013).
- Kwon, C. H., et al. Pten haploinsufficiency accelerates formation of high-grade astrocytomas. Cancer Res. 68, 3286-3294 (2008).
