Summary

皮膚における単一神経終末のin vivo二光子顕微鏡

Published: August 24, 2014
doi:

Summary

動的な縦イメージングレポータートランスジェニックマウスにおける神経終末の選択的レーザ病変のためのプロトコルが提供される。

Abstract

皮膚の神経終末、例えば神経因性疼痛2のような1を感知するように、ならびに病理学的過程における生理学的プロセスに関与している。彼らの近くに対地位置決めが無傷動物の生体における皮膚の神経終末の顕微鏡イメージングを容易にします。多光子顕微鏡を使用して、皮膚組織の強い光散乱の問題を克服精細な画像を得ることができる。 (末梢感覚ニューロンを含む)ニューロンでのThy-1プロモーターの制御下にEYFPを発現するレポータートランスジェニックマウスは、数ヶ月、あるいは生涯までの長期間にわたって個別の神経終末の縦断研究に適しています。さらに、イメージングと同じフェムト秒レーザーを用い、それは神経線維の再構築の研究のために神経線維の高度に選択的な病変を生成することが可能である。ここでは、in vivoイメージング縦多するための簡単で信頼性の高いプロトコルを提示しマウス皮膚の神経終末上のレーザーベースのマイクロサージェリー。

Introduction

皮膚の神経終末は、異なる病態生理学的状態の下での動的な変化を受ける。神経線維は末梢神経障害2またはモートン神経腫3のような疾患の過程で変性および再生や再編のプロセスを経ることができます。外傷後に、皮膚の神経終末ダイナミクスの重要な部分は、損傷を受けた領域の再神経支配である。しかし、神経終末の調査のための一般的なアプローチは、進行中の処理4に関するリアルタイム情報を欠いてex vivoでの組織学的の切片である。遺伝的にコードされた蛍光マーカーを用いて、このように構造変化リッチと有意に関連する情報を取得し、生きている動物の皮膚における神経終末を追跡することが可能である。皮膚の神経終末の調査は、従来の蛍光顕微鏡法を使用して可能であるが、皮膚組織の強い光散乱が強く品質を損なうデータの5を取得した。多光子顕微鏡は、対物レンズの焦点位置からの蛍光の発光をもたらす励起光の光子のエネルギーの非線形和に起因する強散乱組織において高解像度画像の取得を可能にする。この効果は、皮膚組織6の測定のためのロバストな侵入深さの増加および信号対雑音比の向上につながる。イメージングの場合と同じレーザを用いて、神経線維7の選択的な切開を作製することが可能である。以下のプロトコールでは、市販の多光子顕微鏡システムを用いて選択的レーザー病変と組み合わさレポータートランスジェニックマウスにおけるin vivoでの皮膚神経終末の長手方向のイメージングの方法を示す。

Protocol

動物を対象とする手順は、国立動物実験委員会、フィンランドによって承認されている。 イメージングのための1。動物の準備 intraperitionalケタミン(IP)注射(体​​重あたり0.08 mg)およびキシラジン(体重あたり0.01 mg)を、マウスを麻酔。リアつま先ピンチ反射麻酔をチェックしてください。 脱水から目を保護するために目薬(Viscotears)に動物の目を浸し。 低?…

Representative Results

記載された技術を使用して、病変後に同じファイバを追跡し、損傷した神経末端( 図1)の分解を研究することが可能である。 120〜150ミクロンの厚さのスタックの取得は、視野内の全繊維を維持するために数日の間に繰り返しの画像化のための通常適切である。 プラスチック包装材料は、皮膚を平らにするように調整されている場合、病変は、典型的には、…

Discussion

このビデオプロトコルでは、単一の神経終末の非侵襲的な縦二光子イメージングのための方法を実証する。

皮膚神経支配の力学は、乾癬及び末梢神経障害2、のような疾患および外傷9に影響されます。二光子イメージングは​​、コラーゲンマトリックス中の神経線維構造の詳細な分析を可能にする。トランスジェニックレポーターマウスの使用は、神?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は、財政支援のための技術支援のためのNeurotar株式会社CIMO財団とFGSNに感謝したいと思います。

Materials

Round cover glass  Electron Microscopy Science 72296-05 5 mm diameter #1.5 thickness
Eye drops Viscotears Novartis 2mg/g
Superglue Loctite 401 Henkel 135429
Ketaminol Intervet Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gramm of animal weight)
Rompun Bayer Healthcare Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gramm of animal weight)
Working solution is a mixture of Ketamine 10 mg/ml and Xylazine 1.25 mg/ml in PBS
Ethanol 70%
Distilled water or Milli-Q water
Syringes 1ml  BD 300013
30G 1/2" needles BD 304000
Plastic packaging material Could be purchaized from general hardware store
FV-1000MPE microscope Olympus FV-1000MPE Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation
25X XLPlan objective Olympus XLPLN 25XWMP Water imersion objective optimized for multiphoton imaging
Mai-Tai DeepSee laser (2W) SpectraPhysics
Heating pad Supertech TMP-5b Heating pad with a temperature controller
Metal ring fixator Neurotar Ltd.
ImageJ NIH Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/ 
Thy1-YFPH mice strain JaxLab 003782

Referencias

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Citar este artículo
Yuryev, M., Molotkov, D. In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin. J. Vis. Exp. (90), e51045, doi:10.3791/51045 (2014).

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