Summary

In Vivo to-foton mikroskopi af Single nerveender i hud

Published: August 24, 2014
doi:

Summary

Protokollen til dynamisk langsgående billeddannelse og selektiv laser læsion af nerveender i reporter transgene mus præsenteres.

Abstract

Nerveender i huden er involveret i fysiologiske processer, såsom sensing 1, samt i patologiske processer såsom neuropatisk smerte 2. Deres tæt på overfladen positionering letter mikroskopisk billeddannelse af hudens nerveender i levende intakt dyr. Brug multifoton mikroskopi, er det muligt at opnå fine billeder overvinde problemet med stærk lysspredning af hudvævet. Reporter transgene mus, der udtrykker EYFP under kontrol af Thy-1-promotoren i neuroner (herunder periferien sensoriske neuroner) er velegnede til de langsgående undersøgelser af individuelle nerveender over længere perioder på op til flere måneder eller endda livslang. Desuden, ved hjælp af den samme femtosecond laser som til billeddannelse, er det muligt at fremstille yderst selektive læsioner af nervefibre for undersøgelser af omstrukturering nervefibrene. Her præsenterer vi en enkel og pålidelig protokol for langsgående multiphoton in vivo billeddannelse oglaserbaseret mikrokirurgi på musen hud nerveender.

Introduction

Kutane nerveender gennemgår dynamiske forandringer under forskellige patofysiologiske tilstande. Nervefibre kan gå gennem processen med degeneration og regeneration eller omstrukturering i løbet af sådanne sygdomme som perifer neuropati 2 eller Mortons neuroma 3. Efter traumatisk skade, en vigtig del af nerveender dynamik i huden er reinnervation af det beskadigede område. Men den fælles tilgang til undersøgelse af nerveender er ex vivo histologiske sektionering, der mangler oplysninger i realtid om de igangværende processer 4. Brug genetisk indkodede fluorescerende markører, er det muligt at spore de nerveender i huden på levende dyr, og dermed opnå rig og betydeligt mere relevante oplysninger om de strukturelle ændringer. Undersøgelsen af ​​kutane nerveender er muligt under anvendelse af konventionel fluorescensmikroskopi imidlertid stærk lysspredning af hudvævet kraftigt underminerer kvalitetenaf de data, der er erhvervet 5. Multiphoton mikroskopi tillader erhvervelse af billeder i høj opløsning i stærkt spredende væv på grund af den ikke-lineære opsummering af energi excitationslyset fotoner resulterer i emission af fluorescens kun fra brændpunktet af målet. Denne effekt fører til en solid stigning i indtrængningsdybden og forbedring af signal-støj-forholdet for måling i hudvævet 6. Anvendelse af den samme laser som til billeddannelse, er det muligt at fremstille selektiv dissektion af nervefibre 7. I den følgende protokol viser vi metode langsgående afbildning af kutane nerveender i vivo i reporter transgene mus kombineret med selektiv laser læsion under anvendelse af kommercielt tilgængelige multifoton mikroskopsystem.

Protocol

Procedurer, der involverer dyreindivider er blevet godkendt af den nationale dyreforsøg Board, Finland. 1. Animalske Forberedelse til Imaging Bedøver en mus ved intraperitional (IP) injektion af ketamin (0,08 mg pr legemsvægt) og xylazin (0,01 mg pr legemsvægt). Kontroller anæstesi med den bageste tå knivspids refleks. Fordyb dyrets øjne i øjendråber (Viscotears) for at beskytte øjnene mod dehydrering. Sæt musen på en varmepude (Supertech) ved 37 ° C for at forhindre h…

Representative Results

Brug af den beskrevne teknik er det muligt at spore den samme fiber, efter læsionen, og at undersøge nedbrydningen af beskadigede nerveender (figur 1). Erhvervelse af stakken med en tykkelse på 120-150 um er sædvanligvis passende for den gentagne billeddannelse i adskillige dage for at holde hele fiber i synsfeltet. Læsionen kan typisk fremstilles præcist når plastemballage materiale justeres til flade huden, så kollagen lag vises med ensartet intensitet på billedet…

Discussion

I denne video protokol vi demonstrere fremgangsmåden til ikke-invasiv langsgående to-foton-billeddannelse af enkelt nerveender.

Dynamikken i huden innervationer påvirkes ved sådanne sygdomme som psoriasis og perifer neuropati 2, og i traumatiske skader 9. To-foton billedbehandling giver mulighed for en detaljeret analyse af nervefibre strukturer i collagen matrix. Anvendelsen af ​​transgene reporter mus hjælper med at undgå de problemer vedrørende farvning af…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne vil gerne takke Neurotar Ltd for teknisk bistand, CIMO Foundation og FGSN for finansiel støtte.

Materials

Round cover glass  Electron Microscopy Science 72296-05 5 mm diameter #1.5 thickness
Eye drops Viscotears Novartis 2mg/g
Superglue Loctite 401 Henkel 135429
Ketaminol Intervet Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gramm of animal weight)
Rompun Bayer Healthcare Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gramm of animal weight)
Working solution is a mixture of Ketamine 10 mg/ml and Xylazine 1.25 mg/ml in PBS
Ethanol 70%
Distilled water or Milli-Q water
Syringes 1ml  BD 300013
30G 1/2" needles BD 304000
Plastic packaging material Could be purchaized from general hardware store
FV-1000MPE microscope Olympus FV-1000MPE Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation
25X XLPlan objective Olympus XLPLN 25XWMP Water imersion objective optimized for multiphoton imaging
Mai-Tai DeepSee laser (2W) SpectraPhysics
Heating pad Supertech TMP-5b Heating pad with a temperature controller
Metal ring fixator Neurotar Ltd.
ImageJ NIH Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/ 
Thy1-YFPH mice strain JaxLab 003782

Referencias

  1. Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
  2. Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
  3. Wu, K. K. Morton’s interdigital neuroma: a clinical review of its etiology, treatment, and results. J. Foot Ankle Surg. 35, 112-119 (1996).
  4. Lauria, G., Lombardi, R. Skin biopsy: a new tool for diagnosing peripheral neuropathy. BMJ. 334, 1159-1162 (2007).
  5. Cheng, C., Guo, G. F., Martinez, J. A., Singh, V., Zochodne, D. W. Dynamic plasticity of axons within a cutaneous milieu. J. Neurosci. 30, 14735-14744 (2010).
  6. Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo. J Vis Exp. (46), e2062 (2010).
  7. Sacconi, L., O’Connor, R. P., Jasaitis, A., Masi, A., Buffelli, M., Pavone, F. S. In vivo multiphoton nanosurgery of cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).
  8. Robinson, L. R. Traumatic injury to peripheral nerves. Muscle Nerve. 23, 863-873 (2000).
  9. Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  10. Marinkovic, P., Reuter, M. S., Brill, M. S., Godinho, L., Kerschensteiner, M., Misgeld, T. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 4296-4301 (2012).
  11. Amit, S., Yaron, A. Novel systems for in vivo monitoring and microenvironmental investigations of diabetic neuropathy in a murine model. J Neural Transm. 119, 1317-1325 (2012).
  12. Yu, H., Fischer, G., Jia, G., Reiser, J., Park, F., Hogan, Q. H. Lentiviral gene transfer into the dorsal root ganglion of adult rats. Mol Pain. 7, 63 (2011).
  13. Yuryev, M., Khiroug, L. Dynamic longitudinal investigation of individual nerve endings in the skin of anesthetized mice using in vivo two-photon microscopy. J Biomed Opt. 17, 046007 (2012).

Play Video

Citar este artículo
Yuryev, M., Molotkov, D. In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin. J. Vis. Exp. (90), e51045, doi:10.3791/51045 (2014).

View Video