Флуоресценция<em> На месте</em> Гибридизации (FISH) для локализации вирусов и эндосимбиотических бактерий в растений и насекомых тканей
Summary
Мы описываем здесь простой флуоресценции в гибридизация (FISH) метод локализации вирусов и бактерий в насекомых и растительных тканей. Этот протокол может быть продлен для визуализации мРНК в целом горе и срезах.
Abstract
Флуоресценции в гибридизация (FISH) является имя, данное различными методами, обычно используемых для визуализации генных транскриптов в эукариотических клетках и могут быть дополнительно модифицированы, чтобы визуализировать другие компоненты в клетке, такие как инфекции с вирусами и бактериями. Пространственная локализация и визуализация вирусов и бактерий во время инфекционного процесса является важным шагом, который дополняет профилирование экспрессии эксперименты, такие как микрочипы и RNAseq в ответ на различные стимулы. Понимание пространственно-временных инфекции с этими агентами дополняет биологические эксперименты, направленные на понимание их взаимодействия с клеточными компонентами. Несколько методов для визуализации вирусы и бактерии, такие как системы гена-репортера или иммуногистохимических способов отнимают много времени, а некоторые ограничены работать с модельных организмов и включают сложные методики. РЫБЫ, что цели РНК или ДНК видов в клетке является относительно легко и быстро меняТПК для изучения пространственно-временной локализации генов и для диагностических целей. Этот метод может быть надежными и относительно легко реализовать, когда протоколы используют короткий гибридизации, коммерчески-приобретенные зондов, которые не являются дорогими. Это особенно надежной, когда пробоподготовка, фиксация, гибридизация и микроскопическая визуализация не связано с рядом сложных шагов. Здесь мы опишем протокол для локализации бактерий и вирусов в насекомых и растительных тканей. Метод основан на простого приготовления, фиксации и гибридизации насекомых тотальных препаратов и рассеченных органов или ручной частей установки, с 20 пар оснований короткие ДНК-зонды, конъюгированные с флуоресцентных красителей на их 5'-или 3'-концами. Этот протокол был успешно применен к ряду насекомых и растительных тканей, и могут быть использованы для анализа экспрессии мРНК или других РНК или ДНК видов в клетке.
Introduction
При изучении взаимодействия между растительных вирусов и других патогенов с их зараженных растений хозяев, важно, чтобы визуализировать патогены и их соответствующих нуклеиновых кислот в месте, независимо ли они вызывать отрицательные эффекты на их хозяев. Это особенно важно при изучении движения патогена внутри и между клеток растений. В месте локализации генных продуктов возбудителя является важным шагом, который дополняет другие подходы к изучению процесса патогенности. Многие патогены растений, особенно вирусы, передаются насекомыми, имеющие сложные и интимные взаимодействия с их переносчиков. Локализация этих вирусов в их векторов имеет важное значение для изучения путь для передачи, а также возможные сайты взаимодействия внутри вектора. Передача некоторых вирусов растений насекомых-векторная оказывается помощь эндосимбиотических бактерий, которые проживают в пределах этих насекомых. Чтобы лучше изучить передачу этих вирусов растений бу их векторы, важно также, чтобы визуализировать эндосимбиотических бактерии в целом, и тех, кто участвует в передачи вируса, в частности. Колокализации вирусных и эндосимбиотических бактерий Таким образом, желательно за расследование возможных связей между этими организмами в пределах своей насекомых хозяина. Помимо передачи вируса, эндосимбиотических бактерии влияют несколько аспектов биологии насекомых-переносчиков, тем самым пространственная локализация этих бактерий в течение насекомых представляет большой интерес и важность.
Томатный желтый лист локон вирус (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae) является наиболее важным вирусное заболевание комплекс культивируемых помидор по всему миру 1-4. TYLCV это вирус флоэмы ограниченной и исключительно векторением по белокрылки Bemisia tabaci 5,6. Предложена модель, описывающая транслокацию begomoviruses в их белокрылки векторов было предложено 6-9. Два конкретных барьеров активно перешли мажорING этот circulative передач: средняя кишка / гемолимфы и гемолимфы / слюнных желез барьеры. Этот процесс передачи Предполагается, посредничестве неизвестных рецепторов, которые распознают вирус капсида. TYLCV, как полагают, чтобы пересечь B. tabaci средней кишки 6,10, и поглощается через первичный слюнной железы 6, прежде чем он будет введен в растение. В белокрылки гемолимфы, TYLCV взаимодействует с белком GroEL производимого насекомых вторичного эндосимбиотических бактерии Hamiltonella. Это взаимодействие обеспечивает безопасную перевозку TYLCV в гемолимфе, и защищает его от нападения насекомых иммунной системы 11. Hamiltonella и Portiera, первичный эндосимбионта из белокрылки, размещены в bacteriocytes, клетки насекомых, найденные в гемолимфе и дом эндосимбиотических бактерий 11. B. tabaci таит дополнительные эндосимбиотических бактерий, включая риккетсий, Arsenophonus, Wolbachia и Фричаеа, который может быть локализован внутри или за пределами bacteriocytes, и имеют различные эффекты на биологии насекомого 12.
Несколько докладов пытались изучить локализацию TYLCV в растениях и белокрылки с помощью трудоемких и дорогостоящих протоколов, таких как просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), антител и РНК на месте на микроскопическом толщиной разделе 10,13, недавнее исследование описано локализацию растительных вирусов внутри их растений и векторных хозяев, используя простой протокол 14. Здесь мы опишем простой протокол для локализации TYLCV в B. tabaci расчлененный midguts и слюнных желез, и в разделах получены из TYLCV-инфицированных растений. Мы дополнительно описывают локализацию Portiera, первичной эндосимбионта из B. tabaci, и его вторичные эндосимбионты Hamitonella, риккетсии и Arsenophonus. Этот протокол основан на использовании коротких ДНК-зондов, которыефлуоресцентно меченый на их 5'-конце и специфической гибридизации с комплементарными последовательностями в вирусных или бактериальных последовательностей генов. Обработка образца относительно легко и сигнал, полученный высоко специфичен. Описанный протокол может быть использован для локализации вирусы, бактерии и другие патогены в их растений, животных и насекомых хозяев, и может быть дополнительно использован для локализации мРНК в той или иной ткани.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный здесь для локализации вируса растений в ее растения-хозяина и вектора насекомых, и эндосимбиотических бактерий в их конкретном узле белокрылки, могут быть адаптированы для локализации других вирусов в растениях и даже в животных тканях. Кроме того, протокол может б…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
не Исследования в лаборатории Ганим поддержали исследовательского гранта не. 908-42.12/2006 от немецко-израильского фонда (МФП), грант №. IS-4062-07 от Соединенных Штатов-Израиль Двусторонней сельскохозяйственных исследований и развития фонда (бард), и исследовательский грант не. 884/07 от Израиля Science Foundation (ISF), чтобы МГ
Materials
| Fluorescently labeled Probes | Metabion | 20 bp HPLC purified | Sequence designed by customer |
| Toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | Molecular Biology Grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Liquid Blocker | Ted Pella Inc. | 22309 |
Referencias
- Czosnek, H., Laterrot, H. A worldwide survey of Tomato yellow leaf curl viruses. Arch. Virol. 142, 1391-1406 (1997).
- Ling, K. S., Simmons, A. M., Hassell, R. L., Keinath, A. P., Polston, J. E. First report of Tomato Yellow Leaf Curl Virus in South Carolina. Plant Dis. 90, 379 (2006).
- Polston, J. E., McGovern, R. J., Brown, L. G. Introduction of Tomato yellow leaf curl virus in Florida and implications for the spread of this and other geminiviruses of tomato. Plant Dis. 83, 984-988 (1999).
- Polston, J. E., Rosebrock, T. R., Sherwood, T., Creswell, T., Shoemaker, P. J. Appearance of Tomato yellow leaf curl virus in North Carolina. Plant Dis. 86, 73 (2002).
- Frohlich, D. R., Torres-Jerez, I., Bedford, I. D., Markham, P. G., Brown, J. K. A phylogeographical analysis of the Bemisia tabaci species complex based on mitochondrial DNA markers. Mol. Ecol. 8, 1683-1691 (2002).
- Ghanim, M., Morin, S., Czosnek, H. Rate of Tomato yellow leaf curl virus translocation in the circulative transmission pathway of its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Phytopathology. 91, 188-196 (2001).
- Ghanim, M., Rosell, R. C., Campbell, L. R., Czosnek, H., Brown, J. K., Ullman, D. E. Digestive salivary and reproductive organs of Bemisia tabaci (Gennadius) Hemiptera: Aleyrodidae) B type. J. Morphol. 248, 22-40 (2001).
- Hunter, W. B., Hiebert, E., Webb, S. E., Tsai, J. K., Polston, J. E. Location of geminiviruses in the whitefly Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae). Plant Dis. 82, 1147-1151 (1998).
- Rosell, R. C., Torres-Jerez, I., Brown, J. K. Temporal pathway of geminivirus in whitefly extracts, saliva, hemolymph and honeydew. Phytopathology. 89, 239-246 (1999).
- Czosnek, H., Ghanim, M., Ghanim, M. The circulative pathway of begomoviruses in the whitefly vector Bemisia tabaci—insights from studies with Tomato yellow leaf curl virus. Ann. Appl. Biol. 140, 215-231 (2002).
- Gottlieb, Y., et al. The transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virusby the whitefly Bemisiatabaciis correlated with the presence of aspecificsymbiotic bacterium species. J. Virol. 84, 9310-9317 (2010).
- Brumin, M., Levy, M., Ghanim, M. Transovarial transmission of Rickettsia spp. and organ-specific infection of the whitefly Bemisia tabaci. Appl. Environ. Microbiol. 78, 5565-5574 (2012).
- Ghanim, M., Medina, V., Czosnek, H. . Localization of Tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector Bemisia tabaci. In Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease, Management, Molecular Biology, Breeding for Resistance. , 175-187 (2007).
- Ghanim, M., Brumin, M., Popovski, S. A simple, rapid and inexpensive method for localization of Tomato yellow leaf curl virus and Potato leafroll virus in plant and insect vectors. J. Virol. Methods. 159, 311-314 (2009).
- Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. J. Virol. 86, 13241-13252 (2012).
- Nirgianaki, A., et al. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47, 93-101 (2003).
- Baumann, P. Biology of bacteriocyte-associated endosymbionts of plant sap-sucking insects. Ann. Rev. Microbiol. 59, 155-189 (2005).
- Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (Homoptera) Aleyrodidae). App. Environ. Microbiol. 72, 3646-3652 (2006).
- Li, Z. X., Lin, H. Z., Guo, X. P. Prevalence of Wolbachia infection in Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 54, 467-471 (2007).
- Skaljac, M., Zanic, K., Hrncic, S., Radonjic, S., Perovic, T., Ghanim, M. Diversity and localization of bacterial symbionts in three whitefly species (Hemiptera: Aleyrodidae) from the east coast of the Adriatic. Bull. Entomol. Res. 103, 48-59 (2013).
