In vitro modelli di lesioni cerebrali traumatiche sono state sviluppate per riprodurre de deformazione del cervello in vivo. Lesioni Stretch indotta è stato impiegato per gli astrociti, neuroni, cellule gliali, aortica, e le cellule endoteliali cerebrali. Tuttavia, il nostro sistema utilizza una barriera emato-encefalica (BBB), modello che possiede le proprietà che costituiscono un modello legittimo della BBB di stabilire un modello in vitro TBI.
A causa dell'incidente elevata mortalità causata da lesioni cerebrali traumatiche (TBI), metodi che consentano di comprendere meglio i meccanismi di fondo che lo praticano sono utili per il trattamento. Ci sono sia in vivo che in vitro metodi disponibili per questo scopo. In vivo modelli possono mimare trauma cranico effettivo, come avviene durante TBI. Tuttavia, nelle tecniche in vivo non può essere sfruttato per studi a livello fisiologia cellulare. Quindi, metodi in vitro sono più vantaggiose per questo scopo in quanto forniscono un più facile accesso alle celle e l'ambiente extracellulare per la manipolazione.
Il nostro protocollo presenta un modello in vitro di lesioni distensione usando TBI in cellule endoteliali microvascolari cerebrali. Esso utilizza la pressione applicata alle cellule coltivate in pozzetti a fondo flessibile. La pressione applicata può essere facilmente controllata e può produrre lesioni che varia da bassa a grave. Il murinomicrovascolari cerebrali cellule endoteliali (CEND) generati nel nostro laboratorio è un modello molto adatto per la barriera emato-encefalica (BBB), fornendo così un vantaggio per altri sistemi che utilizzano una tecnica simile. Inoltre, grazie alla semplicità del metodo, nelle configurazioni sono facilmente duplicati. Così, questo modello può essere utilizzato nello studio dei meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella TBI presso la BBB.
Lesione cerebrale traumatica (TBI) è una delle principali cause di morte in tutto il mondo. Circa 10 milioni di persone sono colpite ogni anno da TBI rendendolo un importante problema sanitario e medico 1. A causa di questo, diversi in vivo e in vitro di trauma cranico sono stati stabiliti e sviluppato per studiare i meccanismi di 2,3,4. Una migliore comprensione del trauma cranico può contribuire a migliorare il trattamento del paziente e diminuire la mortalità associata, morbilità e costi.
Molti modelli per lesioni cerebrali che utilizzano sia in vivo che in vitro esistono metodi. Modelli in vivo potrebbe imitare l'evento reale della lesione alla testa. Tuttavia, a causa della complessità della situazione in vivo, accessibilità al tessuto di interesse diventa limitato 2. Nella comprensione della risposta fisiologica delle singole celle come conseguenza della ferita inflitta, è importante che le cellule sono isolate dagli effetti sistemici chepuò inibire o alterare la loro risposta individuale 5. Per questo motivo, modelli cellulari di trauma forniscono utili vantaggi rispetto modelli animali poiché l'ambiente meccanico delle cellule può essere controllato con precisione 6.
Sistemi in vitro che impiegano l'uso di carico meccanico alle cellule o tessuti di determinare alterazioni indotte da tale metodo di lesione sono stati sviluppati. Ad esempio, è stato stabilito un metodo per studiare l'effetto di danno meccanico alle cellule di astrociti, neuroni, cellule gliali e cellule endoteliali aortiche 7,8,9. Il modello in vitro trauma stabilito per lo studio dei roditori e reattività astrociti umani 10 impiegato un dispositivo di controllo della pressione identico a quello che usiamo per il nostro modello. Lo stesso metodo è stato applicato per indurre lesioni attraverso tratto in topo cervello microvasi cellule endoteliali (bEnd3) 11 e neuroni corticali 12,13 nonché, endoth cerebralecellule Elial da suinetti neonati 14. Il dispositivo deforma il fondo della cultura ben producendo pertanto un grave stiramento meccanico 10. Essa infligge lesioni upon cellule coltivate mediante l'applicazione di pressione aria sopra le celle. Questa pressione può deviare la membrana su cui le cellule crescono, allungando così le celle. Vari gradi di stiramento (cioè "basso" moderato "o" grave ") può essere raggiunto impostando la durata dell'impulso di pressione dell'aria e l'intensità di conseguenza. Questo metodo di lesioni all'allungamento indotto è stato correlato con lesione traumatica in vivo 7. Inoltre , questo metodo consente di lesioni per il preciso controllo dell'ambiente extracellulare e può essere facilmente riprodotta.
Anche se un approccio simile è stato utilizzato per molti altri tipi di cellule del cervello, comprese bEnd3, il nostro modello è di un vantaggio in quanto fa uso del cervello microvascolari cellule endoteliali murine (CEND) generatonel nostro laboratorio. Questa linea cellulare è un modello molto adatto della barriera emato-encefalica (BBB). Colture cellulari in vitro utilizzati come modelli BBB deve possedere caratteristiche tali da consentire loro di servire come schermo di permeabilità. Un criterio importante per un modello in vitro di cellule di essere un predittore di BBB permeabilità è che dovrebbe possedere un'architettura cellulare fisiologicamente realistico 15. Anche se bEnd3 celle visualizzano distintivo mandrino-come morfologia squamose nella cultura 16, esibiscono un comportamento irregolare morfogenetica in vitro in cui si formano cavità simili a cisti piuttosto che le normali strutture tubolari in fibrina gel 17. Inoltre, quando le cellule sono state iniettate in topi embrionali e neonatale, hanno indotto in rapida crescita dei tumori letali per topi embrionali, ma non nei topi neonati e giovani. Si propone quindi che uno o più processi che regolano il normale crescita endoteliale, la migrazione e la differenziazione sono stati alterati o elimied in questa linea cellulare 18. D'altra parte, morfologiche, valutazione immunocitochimica di misure di flusso endoteliali ed espressione marcatore BBB, bioelettrica, e paracellular dimostrano che il nostro modello BBB CEND è infatti un modello adatto della BBB 19.
Endotelio cerebrale in vivo è caratterizzato da una permeabilità estremamente stretta con trans-endoteliale resistenza elettrica (TEER) compresi tra 2,000-5,000 Qcm 2. Per gli studi di cervello microcircolo proprietà barriera ai prodotti farmaceutici, devono essere considerati restrittività paracellulare e tenuta delle cellule. Nella maggior parte dei capillari del cervello cellule endoteliali (BCEC), questo non è conservato come cellule mostra TEER vanno 50-100 Qcm 2 20. Il cervello endoteliale linea bEnd3 cellulare immortalata genera valori TEER non superiori a 60 Qcm 2 15. In contrasto con la differenziazione delle cellule CEND con terreno contenente siero ridotto visualizzazioneValori che vanno TEER 300-500 Qcm 2 19,21.
Ad oggi, de modelli in vitro di lesioni tratto in cellule endoteliali cerebrali coltivate sono scarse. Quindi, un modello in vitro per il trauma per infortunio tratto utilizzando cellule endoteliali cerebrali che agiscono come modello della BBB potrebbe rivelarsi utile. In questo protocollo, presentiamo un modello in vitro che possono mimare l'impatto effettivo che le cellule del cervello, in particolare il cervello cellule endoteliali microvascolari del BBB, ricevono durante TBI. Il vantaggio principale di questo modello è che la quantità di lesione applicata alle celle nonché l'ambiente extracellulare può essere facilmente controllato in maniera precisa, che consenta un facile riproducibilità sperimentale di set-up.
Gli effetti di lesioni meccaniche in vitro sono stati studiati e sono stati stabiliti metodi per astrociti, neuroni, cellule gliali e cellule endoteliali aortiche 8, 9, 22. Vi è, tuttavia, a tutt'oggi ancora noto modello in vitro di lesioni tratto in cellule endoteliali coltivate cerebrali. Modelli cellulari di trauma forniscono importanti vantaggi rispetto ai modelli animali poiché l'ambiente meccanico delle cellule può essere controllato con precisione 6. Quindi, un modello in vitro per il trauma per infortunio tratto utilizzando cellule endoteliali cerebrali che agiscono come modello della barriera emato-encefalica (BBB), come quello che il nostro protocollo di regali possono rivelarsi utili.
Questo protocollo fa uso di cellule CEND, un modello BBB stabilito nel nostro laboratorio. Dal ripartizione BBB è spesso documentato in pazienti con trauma cranico e trauma cranico è spesso legata alla rottura della BBB, che può portare a formazione di edema 23, 24, il metodo di presented qui possono specificamente essere utilizzato nella realizzazione di studi BBB in relazione al trauma cranico.
In questo modello, è importante prendersi cura di quanta grado di lesione stirata viene applicata alle celle. In quanto le cellule rimangono ferite in ogni caso, e con qualunque quantità di pressione viene applicata, il grado di danno che può influenzare le cellule endoteliali differiscono molto notevolmente da altri tipi di cellule. Cellule endoteliali aortiche sono più resistenti di allungare infortunio di astrociti o cellule gliali miste 9. Inoltre, riparano più rapidamente dopo lesione rispetto agli altri tipi di cellule. Pertanto, per cervello cellule endoteliali, cellule, particolarmente cend maggiore quantità di lesione stirata è necessaria per produrre un alto grado di lesione. Si potrebbe raggiungere il grado desiderato di lesione applicando la pressione corrispondente indicato nella tabella 1. Per le cellule CEND, tuttavia, lesioni gravi è preferito a causa della loro resistenza allo sforzo. I test condotti hanno dimostrato LDHche come aumenta il grado di stirata, più LDH è secreta nel supernatante. Al contrario, le cellule che sono stati dati una bassa quantità di lesioni prodotte tratto LDH in una quantità simile alle cellule di controllo. Come menzionato nel protocollo, si deve fare attenzione che la quantità appropriata di terreno è usato in quanto un aumento o una diminuzione della quantità di mezzo può provocare a differenze nella pressione di picco applicata ai pozzetti. Per esempio, un pozzetto contenente 5 ml di liquido registra una pressione di picco nella media 4,0 psi mentre un pozzetto vuoto registra una media di 3,8 psi quando viene applicata pressione 45 psi. Pertanto, è meglio per spingere il grilletto più volte nel corso di un controllo bene per assicurare che la pressione di picco che viene generato corrisponde alla quantità desiderata.
Nei nostri esperimenti abbiamo utilizzato una vitalità macchia per determinare l'effetto di allungamento alla permeabilità della membrana cellulare. L'ottica delle piastre di coltura flessibile a fondo abbiamo utilizzato ci permette di VIew le cellule colorate direttamente sotto il microscopio. Tuttavia, quando si vuole condurre studi immunolabelling direttamente dopo la stiro-infortunio, possono sorgere difficoltà. In primo luogo, la dimensione e lo spessore della piastra possono rappresentare un problema con alcune piattaforme di osservazione al microscopio. In secondo luogo, l'ottica della membrana flessibile del pozzo possono essere un ostacolo per cancellare la visualizzazione.
Nonostante i limiti suddetti, tuttavia, la procedura descritta può essere utilizzata come modello in vitro di lesioni meccaniche della BBB. Lesione cerebrale traumatica (TBI) implica due componenti, vale a dire, l'ischemia e il trauma. Ischemia può verificarsi come una lesione secondaria seguente TBI in casi in cui si abbia una grave perdita di sangue con conseguente bassa pressione sanguigna o come risultato di rigonfiamento cerebrale limitare l'apporto di ossigeno al cervello. E 'considerato come un ritardato, danno non meccanico rappresentazione di processi patologici consecutivi avviati al momento della lesione 25. Il verificarsi di una ipossiagrave trauma cranico opo è comune 26. Ossigeno deprivazione di glucosio (OGD) è il metodo attualmente utilizzato per modellare l'ischemia in vitro. Così, sottoponendo le cellule a OGD come un insulto secondario alle cellule dopo stiramento può imitare l'incidenza di TBI seguito da ischemia. Quindi, per migliorare il nostro attuale modello in vitro di TBI e modello il più vicino possibile ad un TBI reale come avviene in vivo, in futuro ci sarà anche impiegare OGD in combinazione con lesioni stirata.
The authors have nothing to disclose.
Questa ricerca è stata sostenuta dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondazione tedesca per la ricerca) con il numero di sovvenzione FO 315/4- e del Programma dell'Unione Europea Settimo programma quadro (FP7/2007-2013) Convenzione di sovvenzione n HEALTH-F2-2009-241.778 a CF.
Cell Injury Controller II | Custom Design and Fabrication, Virginia, USA | http://www.radiology.vcu.edu/research/customdesign/cic.html | ||
Name of Materials | Company | Catalog Number | Remarks | |
Bioflex Culture Plate – Collagen Type I | Flexcell, Dunn Labortechnik | BF – 3001C | ||
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | ||
Fetal Calf Serum (FCS) | PAA Laboratories | A15110-1333 | final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 °C) | |
L-glutamine | Biochrom AG | K0282 | Storage: ≤ -15 °C | |
MEM Vitamin | Biochrom AG | K0373 | Storage: ≤ -15 °C | |
Na-pyruvate | Biochrom AG | L0473 | ||
Nonessential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 | Storage at 4 °C | |
Penicilin/Streptomycin | Biochrom AG | A2212 | Storage: ≤ -15 °C | |
Fetal Calf Serum, charcoal stripped (ssFCS) | Life Technologies | 12676-011 | ||
Trypsin-EDTA solution | PAA Laboratories | L11-004 | Storage: ≤ -15 °C | |
Image-iT DEAD Green | Life Technologies | I10291 | Storage: ≤ -15 °C, protected from light | |
Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH) | Roche | 4744926001 | Storage: ≤ -15 °C |