Bir olarak beyin mikrovasküler endotel hücreleri (cend) olarak gerin<em> In Vitro</emKan Beyin Bariyer> Travmatik Beyin Hasarı Modeli
Summary
In vitro travmatik beyin hasarı modelleri in vivo beyin deformasyon yeniden geliştirilmektedir. Streç-kaynaklı yaralanma astrositleri, nöronlar, glial hücreler, aort ve beyin endotelyal hücreler için kullanılmıştır. Ancak sistemimiz in vitro TBI modelinde kurmak için BBB meşru bir modeli oluşturan özelliklere sahip bir kan beyin bariyeri (KBB) modeli kullanır.
Abstract
Travmatik beyin hasarı (TBI), bir daha bu sürece dahil olan altında yatan mekanizmalar sağlayacak yöntemlerin getirdiği yüksek ölüm olayı nedeniyle tedavi etmek için yararlıdır. In vivo ve bu amaçla kullanılabilir in vitro yöntemler de vardır. Bu TBI sırasında oluşur gibi in vivo modeller gerçek kafa travması taklit edebilir. Ancak, in vivo teknikleri hücre fizyolojisi düzeyinde çalışmalar için yararlanılamaz. Bu düzenleme için, hücreler ve hücre dışı ortama daha kolay erişim sağlamak beri Dolayısıyla, in vitro yöntem, bu amaç için daha avantajlıdır.
Bizim protokol beyin mikrovasküler endotel hücreleri TBI'dan kullanılarak streç yaralanma bir in vitro model sunmaktadır. Bu esnek dipli bir kuyu kültürlenen hücrelere uygulanan basınç kullanır. Basınç kolaylıkla kontrol edilebilir uygulanan ve düşük şiddetli aralıkları bu hasara neden olabilir. SıçangilLaboratuvarımızda oluşturulan beyin mikrovasküler endotel hücreleri (cend) böylece benzer bir teknik istihdam diğer sistemler için bir avantaj sağlayan kan beyin bariyeri (KBB) için çok uygun bir modeldir. Buna ek olarak, yöntem, basitliği nedeniyle, deney grubu-up kolayca çoğaltılır. Dolayısıyla, bu model BBB TBI dahil hücresel ve moleküler mekanizmalarının incelenmesi de kullanılabilir.
Introduction
Travmatik beyin hasarı (TBI) dünya çapında önde gelen ölüm nedenlerinden biridir. Yaklaşık 10 milyon insan önemli bir sağlık ve tıbbi sorunu 1 yaparak TBI tarafından yıllık olarak etkilenir. Bu nedenle, in vivo ve in vitro TBI modellerinde çeşitli kurulan ve mekanizmaları 2,3,4 incelemek için geliştirilmiştir. TBI daha iyi anlaşılması, hasta tedavisi geliştirmek ve ilgili mortalite, morbidite ve maliyet azaltmak yardımcı olabilir edilmiştir.
In vivo ve in vitro yöntemler hem kullanmak beyin hasarı için birçok model var. Vivo modellerde kafa travması gerçek olay taklit olabilir. Ancak, in vivo durumda karmaşıklığı, ilgi dokuya erişilebilirlik nedeniyle 2 sınırlı olur. Vurulur hasarının bir sonucu olarak, tek tek hücrelerin fizyolojik tepki anlamada, bu hücrelerin izole edilmesi önemlidir sistemik etkileri hangikendi cevap 5 inhibe veya değiştirebilir. Bu nedenle, travma hücre modellerinin hücrelerin mekanik ortamı tam 6 kontrol edilebildiğinden dolayı, hayvan modelleri üzerinde önemli avantajlar sağlar.
Yaralanma Böyle bir yöntem ile oluşturulan değişikliklerini saptamak için hücreler veya dokular, mekanik yükün kullanımı istihdam in vitro sistemler geliştirilmiştir. Örneğin, hücreler, mekanik hasar etkisini incelemek için bir yöntem astrositleri, nöronlar, glial hücreler ve aortik endotel hücreleri 7,8,9 kurulmuştur. Kemirgen ve bizim model için kullandığınız aynı bir basınç kontrol cihazı kullanılan insan astrosit Tepkime 10 çalışma için kurulan in vitro travma modelinde. Aynı yöntem, fare beyin mikrovasküler endotelyal hücreleri (bEnd3) 11 ve kortikal nöronlar gibi 12,13 yanı sıra, beyin endoth gerilme ile hasara yol uygulandıYeni doğmuş domuz 14 elial hücreler. cihaz böylece mekanik gerilme yaralanması 10 üretiminde de kültür alt deforme eder. Bu hücreler üzerinde hava basıncı uygulanması ile kültürlenmiş hücreler üzerinde hasar uğratan. Bu basınç, böylece hücreler uzanan, hücreler artan edildiği membran saptırmak olabilir. Streç çeşitli derecelerde (", yani" düşük ", orta" ya da "ağır) uygun şekilde hava basıncı darbe süresi ve yoğunluğu ayarlayarak elde edilebilir. Esnetilebilir-kaynaklı yaralanma Bu yöntem, in vivo 7 travması ile ilişkili olmuştur. Dahası , yaralanma bu yöntem, hücre dışı ortamın hassas kontrolünü sağlar ve kolay bir şekilde çoğaltılabilir.
Benzer bir yaklaşım, bEnd3 de dahil olmak üzere pek çok diğer beyin hücre türleri için kullanılabilir olmasına rağmen, bizim modeli fare beyin mikrovasküler endotel hücre (cend) oluşturulur kılan bir avantajdırLaboratuvarımızda. Bu hücre hattı, kan beyin bariyeri (KBB) bir çok uygun bir modeldir. BBB model olarak kullanılan in vitro hücre kültürlerinde onları geçirgenliği ekran olarak hizmet sağlayacak özelliklere sahip olmalıdır. KBB geçirgenliğinin bir belirleyici olarak in vitro hücre modelinde için önemli bir kriter fizyolojik gerçekçi hücre mimarisi 15 sahip gerektiğidir. BEnd3 hücreleri görüntülemek rağmen farklı iğ gibi onlar yerine fibrin jel 17 düzenli tübüler yapılar daha kist benzeri boşluklar oluşturur sayede kültür 16 skuamöz morfolojisi, onlar in vitro düzensiz morfogenetik davranışlar. Ayrıca, hücreleri embriyonik ve yeni doğmuş farelere enjekte edildiğinde, bunlar ancak yeni doğmuş ve genç farelerde embriyonik mice öldürücü hızlı büyüyen tümörlerin neden olmuştur. Bu nedenle, normal endotelyal büyüme, göç, ve farklılaşma yöneten bir veya daha fazla işlem değiştirilmiş veya elimine edilmiş önerilmektedirBu hücre hattı, 18 ed. Öte yandan, endotelyal ve BBB işaretleyici ifade, biyo ve paraselüler akı ölçümlerini morfolojik, immünositokimyasal değerlendirme eden BBB modeli cend gerçekten BBB 19 uygun bir model olduğunu göstermektedir.
In vivo olarak beyin endotel trans-endotel elektrik direnci (TEER) Ωcm 2 2,000-5,000 kadar olan son derece sıkı bir geçirgenliği ile karakterize edilir. Ilaç, beyin mikrovasküler bariyer özelliklerini çalışmaları için, hücreler arasında paraselüler sıkılık ve sızdırmazlık dikkate alınmalıdır. En çok beyin kapiller endotel hücreleri (BCEC), bu hücreler sergi TEER 50-100 Ωcm 2 20 arasında değişen olarak korunur. Ölümsüzleştirilmiş beyin endotelyal hücre hattı bEnd3 hiçbir büyük 15 2 Ωcm 60 den daha TEER değerleri oluşturur. Ihtiva eden ortam ile cend hücrelerinin aksine farklılaşma serum ekran azaltılmış300-500 Ωcm 2 19,21 arasında değişen TEER değerleri.
Bugüne kadar, kültür beyin endotelyal hücrelerinde streç yaralanma in vitro modeller azdır. Bu nedenle, BBB modeli olarak hareket kültürlü beyin endotel hücreleri kullanarak gerilme yaralanması ile travma için bir in vitro model yararlı olduğunu kanıtlayabilir. Bu protokol, beyin hücreleri, BBB özellikle beyin mikrovasküler endotel hücreleri, TBI alınan kabul edilmiş gerçek etkisi taklit ederek bir in vitro model sunuyoruz. Bu modelin avantajı yaralanma miktarı hücreleri hem de hücre dışı ortamda kolayca deneysel kurulum kolay tekrarlanabilirlik sağlayan hassas bir şekilde kontrol edilebilir uygulanabilir olmasıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Astrositleri, nöronlar, glial hücreler ve aortik endotel hücreler 8, 9, 22 in vitro olarak mekanik hasar etkileri incelenmiştir ve yöntem kurulmuştur. Hala kültürlenmiş beyin endotelyal hücrelerinde streç yaralanma in vitro model bilinmektedir Ancak şimdiye kadar, yoktur. Travma Hücresel modelleri hücrelerin mekanik ortamı tam 6 kontrol edilebildiğinden dolayı, hayvan modelleri üzerinde önemli avantajlar sağlar. Bu nedenle, bir kültür endotel beyin hücreleri kullanarak gerilme yaralanması ile travma için in vitro model böyle bizim protokol hediyeler yararlı olduğu ortaya çıkabilir ne gibi kan beyin bariyeri (KBB) modeli olarak hareket.
Bu protokol cend hücrelerin kullanımı, laboratuvarımızda kurulu bir BBB modeli yapar. BBB arıza genellikle TBI hastalarda belgelenmiştir ve TBI genellikle ödem oluşumu 23, 24 neden olabilir BBB bozulması ile bağlantılı olduğundan, yöntem presBurada özellikle ented TBI ile ilgili olarak BBB yürütülmesinde kullanılan olabilir.
Bu modelde, bu streç yaralanma derecesi hücrelerine uygulanan ne kadar dikkat çekmek için önemlidir. Hücreler, herhangi bir durumda, ve uygulanan basınç ne olursa olsun miktarı ile yaralandı kadar olarak, endotel hücreleri etkileyebilir yaralanma derecesi diğer hücre tiplerinde de son derece çok farklıdır. Aort endotel hücreleri astrositlerin veya karışık glial hücreler 9 daha yaralanma germek için daha dayanıklıdır. Diğer hücre tipleri ile karşılaştırıldığında ek olarak, yaralanma sonrası daha hızlı onarım. Bu nedenle, beyin endotelyal hücrelerinde, özellikle cend hücreleri, streç yaralanma daha büyük bir miktarda bir yaralanma yüksek derecede üretmek için gereklidir. Bir Tablo 1 'de gösterilen ilgili basınç uygulayarak yaralanma istenilen ölçüde elde olabilir. Cend hücreler için, ancak, ciddi yaralanma zorlanma onların direnci nedeniyle tercih edilir. LDH yapılan deneyler göstermiştirstreç artar derecesi olarak, daha fazla LDH süpernatanı içine salgılanır. Bunun aksine, gerilme yaralanması, düşük miktarda verilen hücreler kontrol etmek için benzer bir miktarda LDH üretti. Protokolde belirtildiği gibi, bir orta, uygun miktarda ortam miktarında bir artış veya azalma yuvalara uygulanmış tepe basıncı farklılıklara neden olabilir çünkü kullanılan dikkat edilmelidir. 45 psi basınç uygulandığında boş de 3.8 psi'lik bir ortalama kaydeder Örneğin, bir sıvı de içeren 5 ml 4.0 psi ortalama bir tepe basıncı kaydeder. Bu nedenle, elde edilecek tepe basıncı istenen miktarına karşılık gelen sağlamak için iyi bir kontrolü üzerinde tetikleyici birkaç kez itmek için en iyisidir.
Deneylerimizde bir canlılığı, hücre zarının geçirgenliği streç etkisini belirlemek için leke kullanılır. Kullandığımız esnek dipli kültür plakaların optik bize vi sağlarew doğrudan mikroskop altında boyanan hücrelerin. Ancak, bir doğrudan streç-yaralanma sonrası immünoişaretleme çalışmalar yapmak istediğinde, zorluklar ortaya çıkabilir. İlk olarak, plaka boyutu ve kalınlığı bazı mikroskop görüntüleme platformları ile ilgili bir sorun oluşturabilir. İkincisi, kuyunun esnek membran optik görüntüleme temizlemek için bir engel olabilir.
Yukarıda belirtilen sınırlı rağmen, tarif edilen prosedüre BBB in vitro mekanik yaralanmaya için bir model olarak kullanılabilir. Travmatik beyin hasarı (TBI) olmak üzere iki bileşen, iskemi ve travma içerir. İskemi düşük kan basıncı ya da beyin sonucu çıkan ciddi kan kaybı olduğunda örnekleri TBI'dan ardından beyne oksijen kaynağını şişkinlik sınırlayan ikinci bir yaralanma olarak oluşabilir. Bu yaralanma 25 şu anda başlatılan ardışık patolojik süreçleri temsil eden bir gecikmiş, Mekanik olmayan hasar olarak kabul edilir. Hipoksi bir oluşumuFrangoulis ciddi travmatik beyin hasarı sık 26 olduğunu. Oksijen glikoz yoksunluğu (OGD) güncel in vitro modeli iskemi için kullanılan bir yöntemdir. Bu nedenle, germe sonra hücreler için ikincil bir hakaret olarak OGD hücre tabi iskeminin ardından TBI sıklığı taklit edebilir. Bu nedenle, bir in vitro modelinin mevcut geliştirmek TBI ve mümkün olduğunca yakın gerçek bir TBI için in vivo olarak ortaya çıkar deseni, gelecekte daha da gerilme travması ile bir arada OGD kullanacaktır.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Hibe sözleşmesi No SAĞLIK-F2-2009-241778 için altında hibe sayısı FO 315/4- altında Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) ve Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) tarafından desteklenmiştir CF.
Materials
| Cell Injury Controller II | Custom Design and Fabrication, Virginia, USA | http://www.radiology.vcu.edu/research/customdesign/cic.html | ||
| Name of Materials | Company | Catalog Number | Remarks | |
| Bioflex Culture Plate – Collagen Type I | Flexcell, Dunn Labortechnik | BF – 3001C | ||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | PAA Laboratories | A15110-1333 | final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 °C) | |
| L-glutamine | Biochrom AG | K0282 | Storage: ≤ -15 °C | |
| MEM Vitamin | Biochrom AG | K0373 | Storage: ≤ -15 °C | |
| Na-pyruvate | Biochrom AG | L0473 | ||
| Nonessential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 | Storage at 4 °C | |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrom AG | A2212 | Storage: ≤ -15 °C | |
| Fetal Calf Serum, charcoal stripped (ssFCS) | Life Technologies | 12676-011 | ||
| Trypsin-EDTA solution | PAA Laboratories | L11-004 | Storage: ≤ -15 °C | |
| Image-iT DEAD Green | Life Technologies | I10291 | Storage: ≤ -15 °C, protected from light | |
| Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH) | Roche | 4744926001 | Storage: ≤ -15 °C |
Referencias
- Hyder, A. A., Wunderlich, C. A., Puvanachandra, P., Gururaj, G., Kobusingye, O. C. The impact of traumatic brain injuries: a global perspective. NeuroRehabilitation. 22 (5), 341-353 (2007).
- Morrison, B., Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. In vitro centralnervoussystemmodels of mechanicallyinducedtrauma: a review. J. Neurotrauma. 15 (11), 911-928 (1998).
- Albert-Weissenberger, C., Sirén, A. L. Experimental traumatic brain injury. Exp. Transl. Stroke Med. 2 (16), 1-8 (2010).
- Morrison, B., Elkin, B., Dollé, J. P., Yarmush, M. In vitro models of traumatic brain injury. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 91-126 (2011).
- Cargill, R. S., Thibault, L. E. Acute alterations in [Ca2+]i in NG108-15 cells subjected to high strain rate deformation and chemical hypoxia: an in vitro model for neural trauma. J. Neurotrauma. 13 (7), 395-407 (1996).
- Geddes-Klein, D., Schiffman, K., Meaney, D. Mechanisms and Consequences of neuronal stretch injury in vitro differ with the model of trauma. J. Neurotrauma. 23 (2), 93-204 (2006).
- Ellis, E. F., McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Povlischock, J. T. A new model for rapid stretch-induced injury of cells in culture: characterization of the model using astrocytes. J. Neurotrauma. 12 (3), 325-339 (1995).
- McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Ellis, E. F. Stretch-induced injury of cultured neuronal, glial and endothelia cells (Effect of polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase. Stroke. 27 (5), 934-940 (1996).
- Wanner, I. B., Deik, A., et al. A new in vitro model of the glialscarinhibitsaxongrowth. Glia. 56 (15), 1691-16709 (2008).
- Wanner, I. B. An In Vitro Trauma Model to Study Rodent and Human Astrocyte Reactivity. Methods Mol. Biol. 814, 189-219 (2012).
- Berrout, J., Jin, M., O’Neil, R. G. Critical role of TRPP2 and TRPC1 channels in stretch-induced injury of blood-brain barrier endothelial cells. Brain Res. 1436, 1-12 (2011).
- Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Willoughby, K. A., Moore, S. F., Ellis, E. F. Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic brain injury of cortical neurons. Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).
- Zhang, L., Rzigalinski, B. A., Ellis, E. F., Satin, L. S. Reduction of voltage-dependent Mg2+ blockade of NMDA current in mechanically injured neurons. Science. 274, 1921-1923 (1996).
- Gidday, J. M., Beetsch, J. W., Park, T. S. Endogenous glutathione protects cerebral endothelial cells from traumatic brain injury. J. Neurotrauma. 16 (1), 27-36 (1999).
- Gumbleton, M., Audus, K. L. Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as permeability screen for the blood-brain barrier. J. Pharm. Sci. 90, 1681-1698 (2001).
- Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Res. 990 (1-2), 95-112 (2003).
- Montesano, R., Pepper, M. S., Mohle-Steinlein, U., Risau, W., Wangner, E. F., Orci, L. Icreased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behaviour of endothelial cells expressing the middle T oncogene. Cell. 62, 435-445 (1990).
- RayChaudhury, A., Frazier, W., D’Amore, P. Comparison of normal and tumorigenic endothelial cells: differences in thrombospondin production and responses to transforming growth factor-beta. J. Cell Sci. 107, 39-46 (1994).
- Förster, C., Silwedel, C., et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. J. Physiol. 565 (Pt 2), 475-486 (2005).
- Rubin, L. L., Hall, D. E., et al. A cell culturemodel of the blood-brain barrier. J. Cell Biol. 115 (6), 1725-1735 (1991).
- Burek, N. M., Salvador, E., Förster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. J. Vis. Exp. (66), (2011).
- Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Gabler, H. C. Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic injury of cortical neurons. Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).
- Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. Blood brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury. Nat. Rev. Neurol. 6, 393-403 (2010).
- Thal, S. C., Schaible, E. V., et al. Inhibition of proteasomal glucocorticoid receptor degradation restores dexamethasone-mediated stabilization of the blood-brain barrier after traumatic brain injury. Crit. Care Med. , (2013).
- Werner, C., Engelhard, K. Pathophysiology of traumatic brain injury. Br. J. Anaesth. 99 (1), 4-9 (2007).
- Tanno, H., Nockels, R. P., Pitts, L. H., Noble, L. J. Breakdown of the blood-brain barrier after fluid percussion brain injury in the rat: Part 2: Effect of hypoxia on permeability to plasma proteins. J. Neurotrauma. 9 (4), 335-347 (1992).
