호스트 세포 RNA의 합성에 바이러스 감염의 효과를 측정하는 클릭 화학을 사용하여
Summary
이 방법은 리프트 밸리 열병 바이러스 (RVFV) 변형 MP-12와 감염 후 숙주 세포의 전사의 변화를 측정하는 클릭 화학의 사용을 설명합니다. 결과는 형광 현미경을 통해 질적 시각 또는 유동 세포 계측법을 통해 정량적으로 얻을 수 있습니다. 이 방법은 다른 바이러스와 함께 사용하기위한 적응이다.
Abstract
많은 RNA 바이러스는 세포의 방어를 회피하는 수단으로 숙주 세포의 전사를 억제하는 능력을 진화했다. 이러한 바이러스의 연구에 감염된 세포에서 전사 활성을 측정하는 신속하고 신뢰할 수있는 방법을 가지고하는 것이 중요합니다. 전통적으로, 전사는 H-딘 같은 면역 염색을 통해 감지 한 다음 5 bromouridine (BRU) 등 할로겐 딘 유사체의 autoradiography를 또는 섬광 계수 또는 법인을 통해 탐지 다음과 같은 3 등 방사성 클레오의 내장으로도 측정되었습니다. BRU의 검출이 번거로울 수 있습니다 낮은 감도에서 고통 수도 있지만 방사성 동위 원소의 사용은, 그러나, 특수 장비가 필요하며 실험실 설정의 숫자에 적합하지 않습니다.
아 지드와 알킨에서 구리 촉매 트리아 졸의 형성을 포함 최근에 개발 클릭 화학은 이제 신속하고 highl를 제공합니다이 두 가지 방법에 대한 예 민감 대안입니다. 클릭 화학은 초기 RNA가 먼저 형광 지드와 라벨의 검출에 이어 딘 아날로그 5 ethynyluridine (EU)의 결합에 의해 표시되는 두 단계 프로세스입니다. 이러한 지드 시각화 옵션의 넓은 범위를 허용, 여러 가지 형광체로 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 긴장 MP-12 클릭 화학을 사용하여 리프트 밸리 열병 바이러스 (RVFV)에 감염된 세포에서 전사 억제를 측정하는 방법을 설명합니다. 동시에,이 세포에 바이러스 성 단백질의 발현은 고전적인 세포 면역 염색에 의해 결정됩니다. 8 세부 유동 세포 계측법을 통해 전사 억제를 정량화하는 방법을 5 단계 동안, 4 세부 형광 현미경을 통해 전사 억제를 시각화하는 방법을 통해 1 단계를 반복합니다. 이 프로토콜은 다른 바이러스와 함께 사용하기 위해 쉽게 적응할 수있다.
Introduction
전통적으로 전사 활동은 방사성 (3 H-딘 1) 하나의 법인을 통해 측정 또는 초기 RNA로 (BRU) 2 클레오 할로겐되었습니다. 이 딘 유사체는 세포에 의해 촬영 클레오 회수 경로를 통해 딘 – 삼인산 (UTP)로 변환하고, 이후 새로 합성 된 RNA로 통합. 3 H-딘은 많은 시간이 소요될 수 있습니다 기록법, 또는 섬광에 의해 감지 될 수있다 전문 장비를 필요로하는 계산. 또한, 방사성 동위 원소의 사용은 높은 억제 생물 안전성 연구소 등의 실험실 설정의 숫자에 실용적이지 않을 수 있습니다. BRU는 RNA 이차 구조는 항체 바인딩에 대한 입체적 방해가 될 수도로 핵 또는 RNA의 부분적인 변성에 항체의 접근을 보장하기 위해 거친 permeabilization이 필요할 수 있습니다 안티 – BRU 항체로 면역 염색을 통해 감지 할 수 있습니다.
_content "> 여기에서 설명하는 프로토콜은 최근 RVFV 변형 MP-12에 감염된 세포에서 전사 활성을 측정하는 화학 3을 누릅니다 개발했다. 클릭 화학은 매우 선택적이 고 효율적인 구리 (I) 촉매 알킨 사이 사이클로 반응에 의존 활용 4,5 지드 부분은.이 프로토콜에 감염된 세포의 초기 RNA가 먼저 딘 아날로그 EU의 결합을 통해 표시되어 있습니다. 두 번째 단계에서는 통합 된 유럽 연합 (EU)이 형광 지드와 반응을 통해 검출된다.이 방법의 주요 장점은 있습니다 (1) 방사성 동위 원소의 사용을 필요로하지 않습니다 (2) 그 그것은 가혹한 permeabilization 또는 RNA의 변성을 필요로하지 않습니다. 부족에 의해 방해되지 않습니다 미만 50 다, 형광 지드의 액세스 분자량 클래스와 RNA의 검출을 결합 할 때 permeabilization 또는 RNA 이차 구조. 또한, 연구자들은 일차 항체의 자신의 선택에 국한되지 않습니다바이러스 성 단백질의 iCal 면역 염색.두 가지 방법이 프로토콜에 설명되어 있습니다 : 형광 현미경 (1-4 단계) 및 유동 세포 계측법 (5-8 단계)를 통해 전사를 정량화 하나를 통해 전사를 시각화 한. 두 방법 모두 셀 단위 기준으로 전사 활성과 바이러스 감염 사이의 상관 관계를 허용 바이러스 단백질에 대한 세포 면역 염색으로 초기 RNA의 라벨을 결합한다.
저자는 성공적 프로토콜 RVFV 변형 MP-12 6 토스카나 바이러스 (TOSV) 10에 감염된 다른 MP-12 돌연변이 7,8, 9, 세포와 감염된 세포에 감염된 세포에서 전사 활동을 결정하기 위해 여기에 설명 된 사용했습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 쉽게 다른 바이러스와 함께 사용하기 위해 적응 특정 바이러스 또는 세포 단백질의 면역 형광 염색을 포함하도록 수정 될 가능성이있다 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제공되는 프로토콜은 초기 RNA에 딘 아날로그 EU의 결합을 통해 숙주 세포의 전사에 바이러스 감염의 효과를 측정하는 방법을 설명합니다. 그것은 빠르고, 민감하고, 방사성 동위 원소의 사용에 의존하지 않는이 방법은 이전 방법에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 또한,이 방법은 형광 현미경이나 본질적으로 같은 시약을 사용하여 유동 세포 계측법을 통해 정량적 데이터를 질적 데이터를 산출?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 마우스 클론 항 RVFV 항혈청 및 유동 세포 계측법에 대한 도움말 UTMB 유동 세포 계측법 핵심 시설의 M. 그리핀을 제공하는 RB Tesh 감사합니다. 이 작품은 UTMB.OL에서 제임스 W. McLaughlin이 원정대 기금 지원에 의해 지원되었다 UTMB.BK에서 백신 개발을위한 실리 센터에서 서부 지역 우수 센터, NIH 보조금 R01 AI08764301 및 자금 5 ~ U54 AI057156에 의해 지원되었다 모리스 R. Hilleman 초기 경력 조사자 포상 있습니다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ethynyl-uridine | Berry & Associates | PY 7563 | dissolve in DMSO for 100 mM stock |
| 12-mm round coverslips | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| 5 ml polystyrene tubes | BD Biosciences | 352058 | |
| Actinomycin D (ActD) | Sigma | 9415 | dissolve in DMSO for 10 mM stock |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Invitrogen | A-11029 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz | sc-2323 | |
| CuSO4 | Sigma | C-8027 | dissolve in H2O for 100 mM stock |
| DAPI | Sigma | D-9542 | dissolve in H2O for 5 mg/ml stock |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled) | Invitrogen | A10270 | |
| fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled) | Invitrogen | A10277 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | A-5960 | dissolve in H2O for 500 mM |
| paper filter | VWRbrand | 28333-087 | |
| paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| poly-L-lysine (MW ≥ 70000) | Sigma | P1274 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Trizma base | Sigma | T-1503 | dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| Fluorescence Microscope | e.g. Olympus IX71 | ||
| Flow Cytometer | e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa |
Referencias
- Fakan, S. Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus. Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).
- Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine labelling and bromodeoxyuridine antibodies. Cytometry. 14, 455-458 (1993).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15779-15784 (2008).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective “ligation” of azides and terminal alkynes. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 41, 2596-2599 (2002).
- Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).
- Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs protein of rift valley fever virus promotes posttranslational downregulation of the TFIIH subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
- Kalveram, B., et al. Rift Valley fever virus NSs inhibits host transcription independently of the degradation of dsRNA-dependent protein kinase PKR. Virology. , (2012).
- Head, J. A., Kalveram, B., Ikegami, T. Functional analysis of Rift Valley fever virus NSs encoding a partial truncation. PLoS One. 7, e45730 (2012).
- Lihoradova, O. A., et al. Characterization of Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain Encoding NSs of Punta Toro Virus or Sandfly Fever Sicilian Virus. PLoS Negl Trop Dis. 7, e2181 (2013).
- Kalveram, B., Ikegami, T. Toscana Virus NSs Protein Promotes Degradation of Double-Stranded RNA-Dependent Protein Kinase. J. Virol. , (2013).
- Schmaljohn, C., Nichol, S., Knipe, D. M., et al. . In Fields Virology. , 1741-1789 (2007).
- Le May, N., et al. TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
- Caplen, H., Peters, C. J., Bishop, D. H. Mutagen-directed attenuation of Rift Valley fever virus as a method for vaccine development. J. Gen. Virol. 66, 2271-2277 (1985).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious Rift Valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
- Vyboh, K., Ajamian, L., Mouland, A. J. Detection of viral RNA by fluorescence in situ hybridization (FISH). J. Vis. Exp. , e4002 (2012).
- Reich, E., Goldberg, I. H. Actinomycin and nucleic acid function. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 3, 183-234 (1964).
- Holmes, K. L., Lantz, L. M., Russ, W. Conjugation of fluorochromes to monoclonal antibodies. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 4 (Unit 4 2), (2001).
