Enterische Bacteriële invasie van darmepitheelcellen<em> In Vitro</em> Is het drastisch verbeterde Met behulp van een verticale Diffusion Kamer Model

De interacties van bacteriële pathogenen met gastheercellen zijn uitgebreid onderzocht met in vitro celkweek werkwijzen. Het gebruik van dergelijke celkweek testen bacteriële hechting aan gastheercellen geïdentificeerd gastheercel receptoren gastheercel signaalwegen en bacteriële invasie van gastheercellen zijn allemaal in detail bestudeerd, waardoor veel belangrijke observaties. Maar zoals celkweektesten worden uitgevoerd onder aërobe omstandigheden die mogelijk niet representatief voor de in vivo omgeving. Een belangrijke beperking van in vitro modellen gebruikt om gastro-intestinale infecties studeren is dat de kweekomstandigheden, zoals hoge zuurstofgehalte in het algemeen voorstander van eukaryote cel overleving. Echter omstandigheden in de intestinale lumen vrijwel anaërobe. Darmpathogenen in een zeer lage zuurstof omgeving uiten virulentie genen waarvan de expressie veranderingen onder aërobe omstandigheden ^2. Als zodanig verkregen middels standaard celcultuurmodellen may geven een onjuiste indicatie van bacteriële interacties met gastheercellen.

Campylobacter jejuni is de belangrijkste verwekker van bacteriële acute gastro-enteritis wereldwijd, met symptomen die variëren van milde diarree tot ernstige inflammatoire enteritis. De meeste C. jejuni infecties resulteren in ongecompliceerde gastro-enteritis, maar C. jejuni is ook de meest aangewezen besmettelijke agent in perifere zenuwaandoeningen waaronder Guillain-Barre syndroom (GBS). In het Verenigd Koninkrijk, wordt geschat dat er meer dan 500.000 gevallen van enteritis veroorzaakt door C. jejuni infectie elk jaar met een voorspelde kosten voor de Britse economie van £ 580.000.000. In de derde wereld, C. jejuni is een belangrijke oorzaak van sterfte onder kinderen. Ondanks het onbetwistbare belang van Campylobacter infectie en tientallen jaren van onderzoek, met inbegrip van gedegen genomics-gebaseerde analyse, C. jejuni pathogenese is nog steeds slecht understood, in tegenstelling tot andere enterische pathogenen zoals Salmonella, Escherichia coli, Shigella es Vibrio cholerae. Het ontbreken van een geschikte kleine diermodel is een belangrijke reden hiervoor ^3. Ook de gebruikte in vitro infectiemodellen zijn ongeschikt voor het bestuderen Microaërofiele C. jejuni dan voor andere darmpathogenen die facultatieve anaërobe zijn. Hoewel C. jejuni wordt erkend als een invasieve ziekteverwekker, de mechanismen van C. jejuni invasie van intestinale epitheelcellen (IECs) zijn nog onduidelijk ^4,5. C. jejuni invasie is aangetoond dat afhankelijk of microfilamenten, microtubuli, een combinatie van beide of geen ^5. De verwarring in dit gebied is hoogstwaarschijnlijk het gevolg van het gebruik van ongeschikte in vitro assay omstandigheden.

Een aantal verschillende celkweek assays werden gebruikt om de interacties van C. onderzoeken jejunimet gastheercellen. Caco-2 ^{6, 7} INT 407 en T84 ⁸ cellijnen allen toegepast om de hechting en invasie capaciteiten van verschillende C. bestuderen jejuni stammen. De niveaus van bacteriële adhesie en invasie van C. jejuni met IECs zijn dramatisch lager dan bij andere darmpathogenen ^9. De coculturing van C. jejuni met IECs wordt gewoonlijk uitgevoerd in een _CO2 incubator onder omstandigheden dicht bij atmosferische zuurstof, noodzakelijk voor de overleving van IECs. C. jejuni genexpressie zal heel anders zijn in de zuurstofarme omgeving van het darmlumen in vergelijking met atmosferische zuurstof voorwaarden.

Het gebruik van een verticale Diffusion kamer (VDC) systeem ontwikkeld waarbij de co-cultuur van bacteriën en gastheercellen onder verschillende medium en gascondities ^1,10,11 toelaat. Dit systeem bootst de omstandigheden in de menselijke darm waar bacteriën un zalder problemen van zeer lage zuurstof terwijl weefsel worden van zuurstof uit het bloed. Gepolariseerde IEC monolagen gekweekt in speciale 0,4 urn filters werden geplaatst in een VDC creëren van een apicale en basolaterale compartiment, die individueel werden gevuld met bacteriële bouillon respectievelijk celkweekmedium (figuur 1). De VDC werd geplaatst in de variabele atmosfeer incubator bevattende 85% _N2, 5% _{O2 en} 10% _CO2 bij 37 ° C, hetgeen optimale condities voor C. jejuni. De apicale compartiment open gelaten en blootgesteld aan het micro-aërobe atmosfeer binnen de variabele atmosfeer incubator, terwijl de verzegelde basolaterale compartiment werd zuurstof voorzien door een constante toediening van 5% CO _2/95% O ₂ gasmengsel met een uitlaatbuis voorkomen accumulatie van druk . Caco-2 cel overleving en monolaag integriteit onder deze omstandigheden werden bevestigd door het toezicht op de transepitheliaal electrical weerstand (TEER) over de monolaag gedurende 24 uur voor het overleven van de Caco-2 cel monolaag en fysische scheiding van de apicale en basolaterale compartimenten onder lage zuurstofgehalte in het apicale compartiment tonen. De TEER monolagen in VDCs daarvan in de atmosfeer incubator variabele (micro-aërobe omstandigheden) en in een standaard celkweek _CO2 incubator (aerobe omstandigheden) toonde geen significante verschillen, wat aangeeft integriteit van de cel monolaag onder verschillende weersomstandigheden ^1. Onder microaerobe omstandigheden, krappe kruispunten bleef aanwezig en gelijkmatig verdeeld tussen de randen van cellen met een occludin kleuringspatroon vergelijkbaar met cellen gehandhaafd onder aërobe omstandigheden ^1.

De interacties van C. jejuni met Caco-2 en T84 cellen in de VDC werden onderzocht door het beoordelen bacterie interacties (adhesie en invasie) en invasie. Twee verschillende C. jejuni wild-type strains werden ^1. C. jejuni 11168H is een hypermotile afgeleide van de oorspronkelijke volgorde stam NCTC11168. De 11168H stam toont veel hogere kolonisatie niveaus in een kuiken kolonisatie model en wordt dus beschouwd als een geschikte stam te gebruiken voor gastheer-pathogeen interactie studies. 81-176 is een menselijke isoleren en is een van de meest ingrijpende uitgebreid bestudeerd laboratoriumstammen. C. jejuni stammen werden aan het apicale compartiment van een VDC onder hetzij microaerobe of aërobe omstandigheden. We waargenomen hogere tarieven voor zowel de interactie en de invasie werden geregistreerd voor C. jejuni onder micro-aërobe omstandigheden ^1. De toegenomen C. jejuni interacties niet door een toename in bacteriële aantallen onder micro-aërobe omstandigheden ^1. Deze gegevens ondersteunt onze hypothese dat het zuurstofarme omgeving in het apicale compartiment van de VDC verbetert bacterie-gastheer interacties en geeft aan dat de invasieve eigenschappen van C. jejuni zijn incrversoepeld onder deze omstandigheden. Dit was het eerste verslag van het gebruik van het VDC-model om een invasieve bacteriële pathogenen bestuderen en benadrukt het belang van het uitvoeren van in-vitro-infectie testen onder omstandigheden die beter na te bootsen de in vivo situatie. De VDC model kan worden gebruikt om gastheer-pathogeen interacties voor vele verschillende bacteriële species te bestuderen.